[发明专利]一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法

权利要求书

1.一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)非天然氨基酸修饰醛酮还原酶的合成和表达：使用非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸对醛酮还原酶进行修饰，得到不同数量突变位点的醛酮还原酶；

(2)载体活化：将环氧树脂通过一次氨基修饰和二次环辛炔基修饰使其成为带有环辛炔官能基团的环氧树脂载体；

(3)酶的一步纯化和多点固定化：使用环辛炔官能基团的环氧树脂对不同数量突变位点的醛酮还原酶进行固定化，通过炔烃-叠氮化物环加成反应，完成了酶的一步纯化和固定化。

2.根据权利要求1所述的基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，其特征在于：所述醛酮还原酶包括单点突变醛酮还原酶、三点突变醛酮还原酶以及五点突变醛酮还原酶。

3.根据权利要求1或2所述的基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，其特征在于步骤(1)具体为：通过SWISS-MODEL对模拟目的醛酮还原酶的三级结构，通过对活性位点的筛选，对醛酮还原酶目的基因进行定点突变为TAG密码子，将醛酮还原酶目的基因和正交氨酰基-tRNA合成酶/tRNA对pEVOL-pAzF共转化到C321.ΔAstrain，加入抗生素和诱导剂，诱导以获得所需醛酮还原酶。

4.根据权利要求1或2所述的基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，其特征在于步骤(2)中氨基修饰过程为：将环氧树脂聚合物添加到反应水溶液中进行氨基活化，调节溶液pH值至碱性，反应后通过离心，洗涤，干燥得到氨基活化的环氧树脂载体中间体。

5.根据权利要求4所述的基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，其特征在于步骤(2)中环辛炔基修饰过程为：将环辛炔、氨基活化的环氧树脂载体中间体、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶添加到二氯甲烷中，反应后得到环辛炔官能化的环氧树脂。

6.根据权利要求1或2所述的基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，其特征在于步骤(3)具体为：环辛炔官能化树脂载体和收获的不同数量突变位点的醛酮还原酶添加到磷酸盐缓冲液中，并在摇动孵育运转进行固定化，将固定化酶用氯化钠溶液和磷酸盐缓冲液洗涤。

7.根据权利要求4所述的基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，其特征在于环辛炔基修饰具体过程为：向反应水溶液中加入环氧树脂聚合物，加入2eq赖氨酸，通过添加NaOH调节溶液的pH值为9～11；在室温下反应过夜，将反应物取出并离心，用注射器将上清液排干，并将反应物用水洗涤2～5次，并在40～60℃的真空烘箱中干燥。

8.根据权利要求5所述的基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，其特征在于环辛炔基修饰过程具体为：将环辛炔，氨基活化的环氧树脂载体中间体，二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶按摩尔比1：1：1.2：0.5添加到二氯甲烷中，在室温下于黑暗中反应过夜；反应后，溶液用水洗涤3～6次，将环辛炔官能化的树脂在40～60℃的真空干燥箱中干燥。

9.根据权利要求1所述的基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，其特征在于具体包括下述步骤：

(1)非天然氨基酸修饰醛酮还原酶的合成和表达：将醛酮还原酶突变体细胞接种到含有50μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素和100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，并在振荡培养箱中于34℃培养；当OD 600达到0.5时，添加诱导剂L-(+)-阿拉伯糖至终浓度为0.2％(w/v)；在OD600为0.6时，通过添加诱导剂30ng/mL脱水四环素和对叠氮基-L-苯丙氨酸至终浓度1mmol/L诱导蛋白质表达；

(2)载体活化：向3mL反应水溶液中加入环氧树脂聚合物1g，加入赖氨酸15mg，通过添加1mol/L NaOH调节溶液的pH值达到10，将反应在室温下进行过夜，将反应物取出并离心，用注射器将上清液排干，并将反应物用水洗涤3次，并在50℃的真空烘箱中干燥；将100μmoL环辛炔，100μmoL氨基活化的环氧树脂载体中间体，120μmoL二环己基碳二亚胺和50μmoL 4-二甲氨基吡啶添加到2mL二氯甲烷中，在室温下于黑暗中反应过夜；反应后，溶液用水洗涤4次，将环辛炔官能化的树脂在50℃真空干燥箱中干燥；

(3)酶的一步纯化和多点固定化：将0.5g环辛炔官能化树脂载体和3mL收获的培养菌株细胞裂解物的单点，三点，五点突变粗酶上清液添加到1mL磷酸盐缓冲液中，并在20℃摇动孵育以160rpm的转速运转18小时，然后，将固定的酶用1mol/L NaCl溶液和0.02mol/L磷酸盐缓冲液洗涤两次。