[发明专利]一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法

说明书

本发明涉及一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法，使用非天然氨基酸对叠氮基‑L‑苯丙氨酸对醛酮还原酶进行修饰，同时使用环辛炔改性的氨基活化环氧树脂聚合物对酶进行固定化，而且将其作为固体化载体实现与非天然氨基酸修饰的醛酮还原酶进行多点共价连接，通过炔烃‑叠氮化物环加成反应，完成了酶的一步纯化和固定化。通过本发明方法制得的非天然氨基酸修饰的固定化醛酮还原酶在酶活上比游离酶有了很大的提高，并通过无铜点击反应，使醛酮还原酶省去传统繁琐的纯化方法，其中五点固定化可以实现60％的纯化效率。该方法安全可靠且环境污染少，很大程度节约了纯化所耗的时间和成本，适合于工业化生产。

技术领域

本发明涉及一种酶的固定化方法，尤其是涉及一种基于非天然氨基酸修饰酶的多点固定化方法。

背景技术

催化剂酶是从容易获得的可再生资源中产生的，并且是可生物降解的，基本上无害且无毒。在过去的几十年中，酶的应用急剧增加，主要在研究方法学，药物研究，食品改性，化妆品工业的洗衣和造纸工业领域。但是，此类实际应用受到酶的脆弱性(例如，热稳定性低，最适pH范围狭窄，对大多数有机溶剂和许多金属离子的耐受性低等)的阻碍。此外，酶会导致不可避免的纯化和分离步骤。固定化酶为这些挑战提供了简单而优雅的解决方案。固定酶的方法可分为三类：与固相支持物(载体)结合，截留和交联。与预制支撑物的结合可以是物理的(例如疏水性的)，离子的或共价的。这些在所形成的相互作用的类型，特征，所用载体材料的形式和类型方面不同。传统上，所有这些技术都无法控制酶附着或吸附到表面的方向，从而最大程度地减少了不希望的酶与表面的相互作用，最大化了酶的稳定性，并最大化了活性部位的可及性。在各种固定化策略中，酶通过物理吸附或共价键在固体表面的附着建立了最佳实用技术之一。酶-载体共价键的形成牢固且不可逆，具有较高的操作稳定性。

因此，找到有效的共价位点特异性酶固定化方法非常重要。定点突变允许在蛋白质序列的任何位置交换特定氨基酸，从而增加了对连接方向的控制，因为它不仅限于N端或C端修饰。此外，可以在单个酶变体中引入多个定点突变，不仅允许将其定向更改为支持物，而且还可以调节酶与支持物的相互作用及其催化行为。以前的研究证明了共价位点特异性固定技术在潜在的固定位置，如N端或C端区域存在很大的局限性，并且主要依赖于20个规范氨基酸侧链中官能团的修饰。传统规范氨基酸的位点特异性修饰不能满足我们对新共价固定化的需求，因此我们选择非天然氨基酸作为固定化的重要工具。

修饰应发生在酶的特定位点，以最大程度地控制酶的方向并保持其最高活性。研究表明非天然氨基酸的位点特异性结合可以使蛋白质以受控方式固定。遗传密码扩展使用正交的氨酰基-tRNA合成酶对(aaRS)-tRNA指导非天然氨基酸掺入蛋白质，以响应在基因的所需位点引入的未分配密码子(通常为琥珀色终止密码子，UAG)。正交合成酶不能识别内源性tRNA，特别是通过提供给细胞(或由细胞合成)的非天然氨基酸来氨酰化正交同源的tRNA(这不是内源性合成酶的有效底物)。

同样对于蛋白质固定，Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)及其菌株促进的变体(SPAAC)也变得越来越流行。已知铜(I)盐具有细胞毒性，因此研究发现了一种有效的替代方法是由反应的菌株促进形式。为了改善叠氮化物-炔烃环加成的生物相容性，我们试图通过除金属催化以外的其他方法(即通过环应变)活化炔烃。对张力烯烃和炔烃的研究一直持续到1960年代，在此期间，科学家曾经声称最小的稳定的环炔烃环辛炔与苯叠氮化物结合时会“像爆炸一样”发生反应。基于上述理论，我们选择了环辛炔(BCN，Bicyclo[6.1.0]nonyne)作为叠氮化物交联剂，并在合成聚合物载体上对其进行了改性，以完成蛋白质的生物交联。替代无机材料，包括聚苯乙烯(PS)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚碳酸酯(PC)和聚(L-丙交酯)在内的合成聚合物是生物分析中另一种流行的固定化酶载体。合成聚合物的最大优点是支持材料是构建聚合物链的单体可以根据酶的要求和使用固定化产物的过程进行选择。然而，固定化中最麻烦的问题之一是酶的纯化。通常，纯化的蛋白质被广泛用于固定在固相支持物上，但蛋白质的纯化通常费力且昂贵。

发明内容