[发明专利]动物性控精液纯度的检测方法、试剂盒及应用

说明书

本发明涉及生物检测领域，具体而言，提供了一种动物性控精液纯度的检测方法、试剂盒及应用。本发明提供的动物性控精液纯度的检测方法，对含有不同已知浓度比X精子和Y精子的标准品中的X精子和Y精子分别进行real‑time PCR检测，并将X精子和Y精子分别得到的Ct值均作为变量因素与X精子和Y精子浓度比制备标准曲线，然后将待检测样本中的X精子和Y精子的平均值Ct_(i)与标准曲线比对，得到待检测样本中X精子和Y精子的浓度比，从而得到待检测样本的纯度。该检测方法解决了现有技术中检测方法由于不同目标基因及不同引物序列的扩增效率不同而导致的检测结果与实际样本纯度存在系统误差的问题，使得检测结果更加准确。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种动物性控精液纯度的检测方法、试剂盒及应用。

背景技术

动物性别直接影响到畜牧生产的经济效益。性别控制是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预，使雌性动物生产出人们期望性别后代的一门生物技术。X、Y精子分离是性别控制最根本的技术手段，而对于精子分离，无论是方法的建立，还是方法的优化都离不开对精液纯度的评价。

现有技术中，精子分离纯度的鉴定方法主要有：通过后代的性别比例来进行鉴定，该方法周期太长，不利于分离方法的优化，同时成本太高；胚胎细胞学鉴定评价法，该方法胚胎细胞的显微切割及核型分析技术难度较高，胚胎细胞中期染色体分裂相不易获得；胚胎免疫学鉴定评价法，该方法由于抗原本身的特异性和免疫原性不同物种差别大，准确度较差；胚胎分子生物学鉴定评价法，该方法需要将胚胎冲出体外进行检测，耗时也较长，风险较大；流式细胞仪重分析评价法，该方法当X、Y精子间DNA含量差异较小时，准确度也较差。此外，荧光原位杂交评价法和PCR评价法也广泛应用于精子分离纯度鉴定中，然而，这些方法并没有考虑不同目标基因序列及不同引物对的扩增效率对鉴定结果的影响，均存在系统误差。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种动物性控精液纯度的检测方法，以缓解现有技术中检测方法存在系统误差的问题。

本发明的第二目的在于提供一种检测动物性控精液纯度的试剂盒，提供一种准确性好、灵敏度高同时检测时间短，实现高通量的产品。

本发明的第三目的在于提供上述检测方法或试剂盒的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种动物性控精液纯度的检测方法，分别利用X精子引物对和Y精子引物对对待检测样本进行real-time PCR得到Ct_(xi)和Ct_(yi)，再得到Ct_(xi)和Ct_(yi)的平均值Ct_(i)，将待检测样本的Ct_(i)与标准曲线比对，得到待检测样本的纯度；

所述标准曲线包括标准品纯度与标准品Ct的对应关系，其中，所述标准品Ct为第一标准品中Ct_(x)与第二标准品中Ct_(y)的平均值；

利用X精子引物对对第一标准品进行real-time PCR得到Ct_(x)；

利用Y精子引物对对第二标准品进行real-time PCR得到Ct_(y)；

所述标准品包括不同已知浓度比的X精子与Y精子，所述第一标准品中X精子浓度与所述第二标准品中Y精子浓度相同。

进一步地，所述动物性控精液包括牛性控精液，X精子引物对优选为PLP基因引物对，Y精子引物对优选为SRY基因引物对。

进一步地，所述PLP基因引物对的序列如下：