[发明专利]基于荧光定量PCR技术的快速检测大肠杆菌含量的方法

权利要求书

1.基于荧光定量PCR技术的快速检测大肠杆菌含量的方法，其特征在于：方法步骤：

(一)制备LacZ基因系列浓度标准品：

以大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因LacZ基因为检测靶基因，通过化学合成方法合成得到一定质量的具有多个核苷酸的标准靶序列SEQ ID NO.1，根据n＝(m/M)N_A，计算一定质量的标准靶序列所含分子数量，定量后稀释得到LacZ基因系列浓度标准品；其中n为标准靶序列所含的拷贝数，m为标准靶序列的质量，M为标准靶序列的摩尔质量，N_A为6.02×10²³；

(二)绘制标准曲线：

实时荧光定量PCR包括以下组分：2×SYBR Premix Ex TaqII即Tli RNaseH Plus、终浓度为5-20μM的上游引物、终浓度为5-20μM的下游引物、步骤(一)制备的LacZ基因系列浓度标准品和ddH₂O，ddH₂O作为阴性对照使用；以步骤(一)制备的LacZ基因系列浓度标准品为模板，将其10倍梯度稀释，取各稀释梯度模板(0.2-1.5)μl进行荧光定量PCR扩增，反应体系8-35μl，均为三个复孔，扩增程序：(1)(35-65)℃下(1.2-2.5)min；(2)(75-105)℃下(8-18)min；(3)(85-106)℃下(7-26)s；(4)(45-82)℃下(0.6-2.1)min；其中(3)～(4)持续40个循环以标准靶序列模板浓度的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标建立LacZ荧光定量PCR检测的标准曲线；

(三)测量待测样品的大肠杆菌含量：

检测待测样品的Ct值，通过步骤(二)中获得实时荧光定量PCR检测的标准曲线和待测样品的Ct值对比，计算得到大肠杆菌含量。

2.根据权利要求1所述的基于荧光定量PCR技术的快速检测大肠杆菌含量的方法，其特征在于：所述标准靶序列的核苷酸有93个，标准靶序列如SEQ ID NO.1所示；上游引物序列SEQ ID NO.2：5’-CGTACGGGGTATACATGTCTGA-3‘，下游引物序列SEQ ID NO.3：5’-GATTAGGGCCGCAAGAAAACT-3‘。

3.根据权利要求1所述的基于荧光定量PCR技术的快速检测大肠杆菌含量的方法，其特征在于：所述标准靶序列的核苷酸有114个，标准靶序列如SEQ ID NO.4所示：上游引物序列SEQ ID NO.5：5’-GATACACTTGCTGATGCGGTG-3‘，下游引物序列SEQ ID NO.6：5’-CGCCATTTGACCACTACCATC-3‘。