[发明专利]基于荧光定量PCR技术的快速检测大肠杆菌含量的方法

说明书

基于荧光定量PCR技术的快速检测大肠杆菌含量的方法。本发明以大肠杆菌LacZ基因为检测靶基因，通过化学合成方法合成得到一定质量的具有多个核苷酸的标准靶序列，将一定质量的靶序列所含分子数量，定量后稀释得到LacZ基因系列浓度标准品，以LacZ基因系列浓度标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物进行实时荧光定量PCR，绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。同时，根据大肠杆菌LacZ基因特异性片段序列设计并合成一组特异性引物，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。

技术领域

本发明属于分子生物学和体外诊断试剂领域，特别涉及基于荧光定量PCR技术的快速检测大肠杆菌含量的方法。

背景技术

大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，几乎占粪便干重的 1/3，是重要的使人罹患疾病的食源性病原微生物之一。大肠杆菌随粪便排出体外，对周围环境和水源、食品等造成极大的污染。对环境监测时，所取样检查的样品中大肠杆菌越多，表示样品被粪便污染越严重，也表明样品中存在肠道致病菌的可能性越大。我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85中规定的卫生标准对生活饮用水提出了明确要求，每升饮水中大肠杆菌总数不得超过3个。欧美药监局和国家食品药品监督管理总局都对生物制品中大肠杆菌DNA残留量应不高于10ng/剂量，中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)DNA残留量应不高于100pg/剂量。因而，如何快速、准确地检测环境或生物制品中大肠杆菌含量仍有待进一步研究和开发。

发明内容

为了快速、准确地检测环境或生物制品中大肠杆菌含量，本发明提出了一种能够快速、准确且高灵敏性地检测环境样品、生物制品等中大肠杆菌含量的方法，即基于荧光定量 PCR技术的快速检测大肠杆菌含量的方法，具体的方法步骤为：

(一)制备LacZ基因系列浓度标准品

以大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因LacZ基因为检测靶基因，通过化学合成方法合成得到一定质量的具有多个核苷酸的标准靶序列SEQ ID.1，根据n＝(m/M)N_A，计算一定质量的标准靶序列所含分子数量，定量后稀释得到LacZ基因系列浓度标准品；其中n为标准靶序列所含分子数量，m为标准靶序列的质量，M为标准靶序列的摩尔质量，N_A为 6.02×10²³；

例如：合成的LacZ基因片段摩尔质量是30562.8g，质量是32.6ug，依据换算公式：LacZ基因片段的拷贝数(copies)＝(m/M)×6.02×10²³copies，可得出标准靶LacZ基因片段样本拷贝数为：6.42×10¹⁴copies，用无菌去离子水稀释成1.0×10⁸copies/ul，分装并作好标记放入-20℃保存。

(二)绘制标准曲线

实时荧光定量PCR包括以下组分：2×SYBR Premix Ex TaqII即Tli RNaseH Plus、终浓度为5-20μM的上游引物、终浓度为5-20μM的下游引物、步骤(一)制备的LacZ 基因系列浓度标准品和ddH₂O，ddH₂O作为阴性对照使用；