[发明专利]骨髓间充质干细胞膜片的制备方法及其应用

权利要求书

1.骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：用20ml注射器吸取10ml骨髓液，将细胞悬液贴壁缓慢注入到预置有等体积密度为1.077kg/L的人淋巴细胞分离液的试管内，使两者间形成清晰的界面；

S2：以2500r/min离心20min，吸取中间的乳白色云雾状单核细胞层，PBS漂洗，1500r/min离心10min，弃上清，加入含15％FBSDMEM-LG培养液10ml，制成单细胞悬液；

S3：以3×105/cm2密度接种于50ml培养皿内，置入37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，4d后首次半量换液，将未贴壁的细胞全部弃掉，以后每2～3d全量换液一次；

S4：待细胞汇合成单层后，以0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化，即得到原代MSCs悬液，再以1×10⁴/cm2的密度以1：2传代培养以形成细胞膜片；

S5：倒置显微镜观察细胞生长；

S6：绘制细胞生长曲线；

S7：测定贴壁率并绘制贴壁率曲线。

2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S1中，注射器内含稀释的肝素钠2500U/ml约0.5ml。

3.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S1中，骨髓液的吸取方法为选髂后上棘穿刺点，无菌条件下局部麻醉后骨髓穿刺针穿刺成功后拔出针芯，接含有5ml生理盐水和肝素(100U/ml)的10ml注射器穿刺抽取骨髓10ml。

4.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S2中，用于离心的离心机为台式高速离心机。

5.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S5中，利用倒置相差显微镜逐日对细胞生长情况和形态变化特点进行观察，并照相。

6.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S6中，取第3～5代细胞，以每孔5×10⁴个接种于24孔培养板内，上述条件培养，每天取3孔，连续7d，采用血球计数板计数法计数每孔的细胞数。

7.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S7中，取第3代细胞，以每瓶5×10⁴个接种于50ml培养瓶内培养，每2h取2瓶，倒掉培养液(含未贴壁细胞)，0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞并记数，计算贴壁率。

8.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片在治疗心肌缺血再灌注损伤上的应用。