[发明专利]骨髓间充质干细胞膜片的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了骨髓间充质干细胞膜片的制备方法及其在治疗心肌缺血再灌注损伤上的应用。利用密度梯度离心、细胞贴壁和细胞冻存的方法提取扩增细胞，可以获得足够量的未分化的较为单一的MSCs，增殖能力较强，纯度高，可以作为组织工程的种子细胞，为组织工程血管的构建提供依据。而且较Reyes方法去除了免疫磁珠选择的步骤，在实际应用中减少了昂贵的费用，操作中减少了污染的机会。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及骨髓间充质干细胞膜片的制备方法及其应用。

背景技术

根据2017年中国心血管病报告的统计，心血管病患病率及死亡率仍在上升，高于肿瘤及其他疾病，居首位。心肌缺血再灌注损伤是由各种原因引起的心肌缺血(比如心脏外科手术、心脏移植、心肌梗死等)，无血液流向心脏组织而致氧失衡，产生心脏功能紊乱或心肌组织受损，及时有效恢复心肌缺血部位的血液灌注，能够减少缺血心肌损伤及坏死，但是会引起组织进一步损伤的现象。心肌缺血再灌注损伤的发生机制包括氧自由基爆发、生理pH值快速恢复、胰岛素抵抗、细胞钙超载、线粒体损伤、炎性反应等；目前还无有效的方法治疗心肌缺血再灌注损伤，而一些药物和细胞治疗等被作为研究目标，常见的干预药物有舒芬太尼、阿托伐他汀等，药物治疗心肌缺血再灌注损伤缺陷在于达到治疗效果的耗时较长，且多数药物均呈现出时间依赖性。

近年来，随着干细胞治疗技术的快速发展，一些研究人员也将骨髓间充质干细胞应用于心肌缺血再灌注损伤治疗中。骨髓间充质干细胞表现出强大的心肌组织再生潜力，在心肌梗死后移植骨髓间充质干细胞治疗，可以显著减小心肌梗死面积，减少瘢痕形成和增加新生血管数量，表现出显著疗效。

骨髓间充质干细胞是一种来源于哺乳动物骨髓基质中的除造血干细胞以外的一类具有保留体外自我复制能力、多向分化潜能的干细胞。在标准培养条件下，可表达细胞表面标记CD105、CD73和CD90，而不表达细胞表面标记CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79、CD19或HLA-DR，其具有自我更新、多向分化潜能、可体外大量扩增等干细胞生物学特性。心肌梗死后移植骨髓间充质干细胞能够增加新生血管数量，减小梗死面积，减少瘢痕。骨髓间充质干细胞在一定条件下被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、神经元及肝细胞等。刘煜昊等直接证据表明，人骨髓间充质干细胞能分化为心肌细胞和血管内皮细胞。研究显示，骨髓间充质干细胞具有低免疫原性。骨髓间充质干细胞及其分化细胞表达的细胞外基质分子如黏附分子和整合素参与构成了支持造血的微环境，帮助造血干细胞的黏附和归巢以及细胞间的相互黏附。骨髓间充质干细胞分泌的细胞因子对造血干/祖细胞的自我更新与分化起重要调节作用。

发明内容

本发明的主要目的是提供骨髓间充质干细胞膜片的制备方法及其应用，旨在提高骨髓间充质干细胞的生存能力及治疗效果。

为实现上述目的，本发明的第一目的是提供骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，包括以下步骤：

S1：用20ml注射器吸取10ml骨髓液，将细胞悬液贴壁缓慢注入到预置有等体积密度为1.077kg/L的人淋巴细胞分离液的试管内，使两者间形成清晰的界面；

S2：以2500r/min离心20min，吸取中间的乳白色云雾状单核细胞层，PBS漂洗，1500r/min离心10min，弃上清，加入含15％FBSDMEM-LG培养液10ml，制成单细胞悬液；

S3：以3×105/cm2密度接种于50ml培养皿内，置入37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，4d后首次半量换液，将未贴壁的细胞全部弃掉，以后每2～3d全量换液一次；

S4：待细胞汇合成单层后，以0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化，即得到原代MSCs悬液，再以1×10⁴/cm2的密度以1：2传代培养以形成细胞膜片；

S5：倒置显微镜观察细胞生长；

S6：绘制细胞生长曲线；