[发明专利]打靶载体及构建白喉毒素调控清除巨噬细胞的F4/80-DTR转基因小鼠的方法和应用

权利要求书

1.一种打靶载体，其特征在于：所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.8所示，命名为F4/80 5HA L-IRES-DTR-PGK-EM7-NEO-F4/80 3HA L-MCL-HSV TK载体。

2.一种用于构建如权利要求1所述打靶载体的提取载体，其特征在于：所述提取载体序列如SEQ ID NO.7所示，命名为载体retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK。

3.一种提取载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)以RP23-212F14 BAC DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.3所示的基因片段F4/805’侧同源臂；以RP23-212F14 BAC DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQ ID NO.6所示的基因片段F4/80 3’侧同源臂；

(2)将retrieval 5HA和retrieval 3HA克隆至带阴性选择标记的载体MCL-HSV TK，得到序列如SEQ ID NO.7所示的打靶载体retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK。

4.一种打靶载体的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(1)电穿孔法将质粒pRED/ET转化入BAC Clone F4/80-IRES-DTR-PGK-EM7-Neo，并用L-阿拉伯糖诱导Red/ET表达；

(2)电穿孔法将利用SpeI酶切线性化的retrieval 5HA-retrieval 3HA-MCL-HSV TK提取载体转化入上述表达RED/ET的BAC Clone F4/80-IRES-DTR-PGK-EM7-Neo，同源重组得到序列如SEQ ID NO.8所示的带有F4/80 5’同源臂(～20kb)和3’同源臂(～2kb)的打靶载体，命名为打靶载体F4/80 5HA L-IRES-DTR-PGK-EM7-NEO-F4/80 3HA L-MCL-HSV TK；

(3)挑选单克隆，利用序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物和序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物作菌落PCR，成功提取IRES-DTR-PGK-EM7-NEO和F4/80同源臂的载体能够得到2341bp的条带。

5.一种打靶载体在靶向整合外源基因IRES-DTR至F4/80外显子22位点，构建白喉毒素调控清除巨噬细胞的F4/80-DTR转基因小鼠的应用。

6.根据权利要求5所述的构建白喉毒素调控清除巨噬细胞的F4/80-DTR转基因小鼠的应用，其特征在于，所述转基因小鼠的构建方法包括以下步骤：

(1)构建靶向整合外源基因IRES-DTR至F4/80外显子22位点构建小鼠胚胎干细胞株；

(1.1)电穿孔法将利用BamHI酶切线性化的打靶载体F4/80 5HA L-IRES-DTR-PGK-EM7-NEO-F4/80 3HA L-MCL-HSV TK转入ES细胞；

(1.2)利用G418阳选和ganciclovir阴选，筛选选得到靶向插入IRES-DTR-PGK-EM7-NEO至F4/80外显子22位点的Balb/c ES细胞克隆；

(1.3)提取ES细胞基因组DNA为模板，利用序列为SEQ ID NO.11的正向引物和序列为SEQ ID NO.28的反向引物进行PCR鉴定，靶向插入IRES-DTR-PGK-EM7-NEO至F4/80外显子12位点的ES细胞阳性克隆可见约2.2kb条带；

(2)靶向插入IRES-DTR至F4/80外显子22位点的ES细胞注射入C57BL/6J囊胚，再接种到假孕的KM母鼠子宫中，出生得到毛色为黑色和白色混杂嵌合体小鼠；

(3)提取转基因小鼠鼠尾DNA作为模板，利用序列为SEQ ID NO.27的正向引物和序列为SEQ ID NO.28的反向引物作PCR鉴定，带有IRES-DTR的阳性小鼠可见约2.2kb条带；

(4)利用白色占比最高的5只雄性转基因嵌合体小鼠与BALB/c雌鼠交配，得到毛色为白色的小鼠可能为F4/80-DTR转基因杂合小鼠。小白鼠经鼠尾PCR鉴定后得到F4/80-DTR转基因小鼠。