[发明专利]打靶载体及构建白喉毒素调控清除巨噬细胞的F4/80-DTR转基因小鼠的方法和应用

说明书

本发明涉及动物模型构建领域，具体公开了一种打靶载体及构建白喉毒素调控清除巨噬细胞的F4/80‑DTR转基因小鼠的方法和应用，所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.8所示，命名为F4/80 5HA L‑IRES‑DTR‑PGK‑EM7‑NEO‑F4/80 3HA L‑MCL‑HSV TK载体。胞生产和培育转基因小鼠的方法和应用实例。本发明构建得到的白喉毒素调控清除组织固有巨噬细胞的F4/80‑DTR转基因小鼠动物模型组织固有巨噬细胞清除效率达70％‑90％，能够较好地清除组织固有巨噬细胞，且在不用白喉毒素诱导时巨噬细胞功能不受影响，利用白喉毒素诱导清除巨噬细胞时无副反应，提供了一种全新的组织固有巨噬细胞清除的原理和方法，提供了一种全新的组织固有巨噬细胞可诱导清除的动物模型。

技术领域

本发明涉及动物模型构建领域，主要是一种打靶载体及构建白喉毒素调控清除巨噬细胞的F4/80-DTR转基因小鼠的方法和应用。

背景技术

单核巨噬细胞系统包括骨髓中的前单核细胞，外周血中的单核细胞和组织中的巨噬细胞。近年来研究发现，大部分组织中的巨噬细胞是组织固有的，而且早在胚胎发育时期就形成了，并且在组织中自我更新和维持稳态，而与成年后外周血中单核细胞无关。不同组织中的巨噬细胞可以有组织特异性的功能，如脑中的巨噬细胞(即小胶质细胞)能够在发育过程中修剪突触，脾红髓巨噬细胞能够吞噬红细胞回收血红素，腹腔巨噬细胞通过与腹膜B细胞相互作用调节肠道免疫球蛋白IgA的产生。在癌症的发生发展中，肿瘤相关巨噬细胞也发挥了重要作用。因此，研究组织中的组织固有巨噬细胞的功能具有重要意义。

研究巨噬细胞，一个很重要的实验就是在体内清除巨噬细胞。现有的较为成熟的巨噬细胞清除体系主要有氯化钆和氯膦酸二钠脂质体法，其主要原理是巨噬细胞吞噬氯化钆或氯膦酸二钠脂质体，经溶酶体水解释放钆离子或氯膦酸根离子，并对巨噬细胞产生毒性作用和诱导凋亡。然而这些方法依赖于巨噬细胞的吞噬能力，吞噬能力较弱的巨噬细胞无法被清除，并且清除巨噬细胞的特异性不够强，一些拥有较强吞噬能力的非单核巨噬细胞，如中性粒细胞，也会吞噬氯化钆或氯膦酸二钠脂质体，从而功能受到影响，并可能产生副反应。为了研究组织中的组织固有巨噬细胞的功能，开发能够在体内特异性清除组织中组织固有巨噬细胞的动物模型具有重要作用。

白喉毒素受体-白喉毒素(DTR-DT)系统是近年来发展起来的一种用于诱导特定细胞群凋亡的系统。白喉毒素(DT)是白喉棒状杆菌产生的一种毒素，包含A和B两个亚基，而白喉毒素受体(DTR)又称人类肝素结合的表皮生长因子样生长因子(hbEGF)。当DT通过B亚基与DTR结合时，整个毒素将通过受体介导的内吞作用内化，毒素的亚单位A随后可抑制蛋白质的翻译，导致细胞凋亡而死亡。啮齿类动物的hbEGF因为3个氨基酸的变化，对DT的亲和力比人类低10³-10⁵倍，所以给小鼠注射DT可以特异性诱导表达DTR(即人类hbEGF)的细胞群体凋亡，从而特异性清除该细胞群体，并且无明显副反应。

F4/80又被称为含表皮生长因子样黏液素样激素受体样1(EMR1)，它广泛表达于许多髓系细胞，包括单核细胞、巨噬细胞，但不包括中性粒细胞。并且敲除F4/80不影响巨噬细胞的存活和功能。最近，有研究表明组织固有巨噬细胞通常表达更高的F4/80水平，所以我们选择F4/80作为驱动DTR表达的基因构建转基因小鼠，这样在高表达F4/80的组织固有巨噬细胞中会高表达DTR，而低表达或不表达F4/80的其他细胞中低表达或不表达DTR，注射合适剂量的DT就可以选择性地诱导组织固有巨噬细胞凋亡。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种打靶载体及构建白喉毒素调控清除巨噬细胞的F4/80-DTR转基因小鼠的方法和应用。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。一种靶向打靶载体，所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.8所示，命名为F4/80 5HA L-IRES-DTR-PGK-EM7-NEO-F4/80 3HA L-MCL-HSV TK载体。