[发明专利]一种人血浆RASSFlA基因甲基化检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种人血浆RASSFIA基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括：针对人RASSFIA基因启动子区中CpG富集位点设计的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的甲基化特异性引物对。

2.根据权利要求1所述的人血浆RASSFIA基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括血浆收集试剂、血浆游离DNA提取试剂、血浆游离DNA的CT转换处理试剂和荧光定量MSP扩增试剂。

3.根据权利要求2所述的人血浆RASSFIA基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，

所述血浆收集试剂含：抗凝剂；

所述血浆游离DNA提取试剂含：裂解液GHH、Proteinase K、Carrier RNA、磁珠、缓冲液、漂洗液、洗脱缓冲液；

所述血浆游离DNA的CT转换处理试剂含：CT Conversion粉剂、M-Dilution Buffer、M-Dissolving Buffer、水、M-Binding buffer、M-Wash Buffer、M-Desulphonation Buffe、HPLC级水；

所述荧光定量MSP扩增试剂含：2×multiplex PCR premix、序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示的引物对、序列如SEQ ID No.3所示的荧光探针和无菌水。

4.一种如权利要求1-3中任一项所述的人血浆RASSFIA基因甲基化的检测试剂盒在评估RASSFlA基因在血浆肿瘤循环DNA中的含量中的应用。

5.一种如权利要求1-3所述的检测试剂盒进行人血浆RASSFIA基因甲基化的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、将采集的血样进行预处理；

B、将经预处理后的血浆采用磁珠法进行提取获得血浆游离DNA；

C、采用亚硫酸氢盐法将血浆游离DNA进行化学修饰，再进行CT转换处理后重新提取DNA；

D、将步骤C处理后获得的DNA样本进行荧光定量MSP检测；

E、以标准品血浆DNA的扩增结果制定外标准曲线，对待测样本进行定量结果分析。

6.根据权利要求5所述的人血浆RASSFIA基因甲基化的检测方法，其特征在于，步骤A中，所述预处理具体方法包括：

A1、将采集的血样与抗凝剂充分混匀后，离心，吸取白细胞层上方5mm的血浆至EP管中；

A2、将血浆再次离心，吸取至新EP管中，并检测血浆的溶血、脂血状态。

7.根据权利要求5所述的人血浆RASSFIA基因甲基化的检测方法，其特征在于，步骤B中，所述采用磁珠法进行提取获得血浆游离DNA具体方法包括：

B1、将经预处理后的血浆、裂解液、Proteinase K和Carrier RNA在离心管中混合均匀后加入磁珠，震荡混匀，室温孵育；

B2、步骤B1处理后进行磁珠吸附处理，待磁珠完全吸附时去除液体；

B3、经步骤B2处理后在离心管中加入缓冲液，上下颠倒混匀，使磁珠充分悬浮；

B4、将离心管再进行磁珠吸附处理，待磁珠完全吸附时去除液体；

B5、经步骤B4处理后在离心管中加入漂洗液，上下颠倒混匀，是磁珠充分悬浮；

B6、重复步骤B4和B5；

B7、将离心管再进行磁珠吸附处理，待磁珠完全吸附时去除液体，然后室温晾干；

B8、经步骤B7处理后在离心管中加入洗脱缓冲液，使磁珠重新悬浮，孵育，使核酸充分洗脱；

B9、将步骤B8处理后在进行磁珠吸附处理，待磁珠完全吸附时将含核酸的液体移出，即可。