[发明专利]一种人血浆RASSFlA基因甲基化检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供一种人血浆RASSF1A基因甲基化检测试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括：针对人RASSFIA基因启动子区中CpG富集位点设计的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的甲基化特异性引物对。本发明的检测方法解决了手术标本的获取创伤性大，甲基化的检出率也相对较低等缺陷。检测针对RASSFlA基因启动子区中CpG位点，特异性强、获取容易、创伤性小。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种人血浆RASSFlA基因甲基化检测试剂盒及检测方法，尤其是在人血浆肿瘤循环DNA中的检测。

背景技术

近年来，随着肿瘤表观遗传学形成机制的研究深入，DNA甲基化作为一种新型分子标志，在肿瘤诊断中的重要性日益受到重视。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase，DMT)，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为供体，将甲基转移到待定的碱基上的过程。在肿瘤形成中，DNA甲基化是最普遍的能被识别的基因异常现象之一，且大部分特定基因的启动子区高甲基化发生在肿瘤发生发展的早期，其紊乱可表现为基因组整体的低甲基化(hypomethylation)以及特定区域(如启动子区域)高甲基化，发生在特异性基因的启动子区域的CpG岛的胞嘧啶上，阻断转录因子的结合，从而特异性基因的表达被沉默。而研究结果提示亚硫酸氢盐能使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶(C)脱氨基转变成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不变。由于尿嘧啶与胸腺嘧啶(T)相似，在DNA聚合反应过程中可以作为胸腺嘧啶，根据修饰后的差异DNA设计PCR引物，当进行PCR反应时，在扩增后的产物中变成胸腺嘧啶，而5-甲基胞嘧啶在亚硫酸氢盐处理过程中不发生改变，经PCR扩增后的产物依然是胞嘧啶，最后对PCR产物进行分析就可判断CpG位点是否发生甲基化，即为甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)。肿瘤相关的基因的启动子甲基化是癌症的重要指标，包括癌症的诊断和早期检测，致癌基因的风险预测，癌症预后的预测，治疗后的随诊，抗癌治疗的反应的预测。甲基化检测对肿瘤早期诊断有潜在的应用价值。

其中比较突出的有与早期肺癌相关的RASSF相关区域家族1A基因(ras-association domain family 1A，RASSF1A)，它是定位于肿瘤高频杂合性丢失区域3p21.3位点的抑癌基因，编码一个微管相关蛋白。该基因在多种实体瘤组织中因启动子高甲基化而表达沉默，是迄今为止在肿瘤组织中甲基化程度最高的基因之一。大多数研究都表明RASSF1A在信号转导和细胞分裂方面均能发挥作用。启动子区的CpG岛甲基化是RASSF1A基因失活的最主要机制，RASSF1A基因低表达或不表达，使其同时丧失了原有的两个重要功能：1.抑制细胞生长，2.促进细胞凋亡。

正常人循环血液中存在少量游离DNA(约10ng/ml)，而肿瘤患者血浆DNA水平远远高于正常人(超过100ng/ml)。肿瘤患者循环血中游离DNA主要是肿瘤细胞凋亡或组织坏死后释放，并且保持有肿瘤细胞DNA的生物学特征改变。检测外周血游离DNA中基因甲基化的状态可能反应出患者肿瘤细胞的甲基化状态。鉴于理想的分子标志物出现在疾病发生的早期含量较低，所以迫切需要寻找高灵敏度和无创性的早期检测手段。MSP方法操作简便，应用广泛，可以对外周血肿瘤游离DNA甲基化进行一个定性研究，对于早期恶性肿瘤的检测有较好的预测作用，但在临床应用价值上尚需更灵敏的检测手段。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种人血浆RASSFlA基因甲基化检测试剂盒及检测方法，尤其是在人血浆肿瘤循环DNA中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种人血浆RASSFIA基因甲基化检测试剂盒，包括：针对人RASSFIA基因启动子区中CpG富集位点设计的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的甲基化特异性引物对。

本发明针对人RASSF1A基因启动子区中CpG富集位点设计特异性引物和taqman荧光探针：