[发明专利]一种鉴别冬虫夏草及其商品真伪PCR引物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种鉴别冬虫夏草及其商品真伪PCR引物、试剂盒及方法。本发明首次使用含一定酚酞的NaOH溶液实现了微量样品的DNA提取，使得提取时间从4～8个小时缩短到1分钟。而且根据不同冬虫夏草及其替代品多种单倍型的ITS序列特征进行引物的设计，结合PCR使得本发明灵敏度高，特异性强，适合冬虫夏草及其替代品样品的检测，具有极高的应用价值。

技术领域

本发明属于核酸检测领域，涉及一种鉴别冬虫夏草及其商品真伪PCR引物、试剂盒及方法。

背景技术

冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)又称虫草。作为名贵药材的一种，深受老百姓推崇。近30年来，由于自然环境的恶化、开发过度等原因，野生资源越来越少，相应的替代品如蛹虫草(也称北虫草)被开发出来，且广为应用。另外，虫草价格不菲，其伪品如凉山虫草Cordyceps liangshanensi、亚香棒虫草Cordyceps hawresii Gray、新疆虫草Cordycepssp.与虫草外观十分类似，也曾一度扰乱虫草市场。虫草化学鉴别指针单一、分析困难、步骤繁杂、代价高，故而很多替代品掺到虫草的粉末、制剂等其他类型的加工品中，如地蝅Stacbys geobombycis、僵蝅Beauveria bassiana、金蝉花Cordyceps sobolifera等等。

大量报道显示，中药材DNA的特定片段(如ITS序列)的特异性扩增或者直接测序可以有效鉴别冬虫夏草来源的商品，且基于PCR目标条带扩增的方法被认为是目前最为有效的药材基源鉴别方法。然而，现有市售的冬虫夏草鉴定试剂盒所使用的分子鉴定方法存在着严重的检测弊端和鉴定风险。

首先，现有分子鉴定方法中的DNA提取技术，均采用传统的CTAB法或者SDS提取法，或者基于传统DNA提取方法的在核酸沉淀、纯化过程中稍作改进的CTAB法。这种DNA提取法的最大负面特点就是耗时长、提取样品用量大；其次，所报道的分子鉴定方法或者鉴定试剂盒均采用真菌类药材通用引物进核糖体ITS序列的扩增，而由于测试样品表面或基质内常常携带很多内源性或外源性引入的多种真菌、霉菌等污染，因此通用引物扩增结果则很容易出现假阳性的结果。

由于冬虫夏草广泛地分布于青藏高原及横断山脉西南面，不同海拔和纬度的生态环境孕育出了超过10多种基因单倍型的种群。故通用的PCR引物扩增的条带不仅容易出现污染物的假阳性，直接测序的结果也往往会因为多种单倍型的杂合严重影响测序的结果。另外，传统的DNA提取方法在现代中药材制剂，如口服液、颗粒剂、片剂等的应用上往往受到严峻的挑战，市售的冬虫夏草商品包含了多种形式的现代制剂。因此常规检测中，DNA提取的质量和产品均受到严重的挑战，实验人员往往花费大量时间、多次重复以及大量的样品进行检测，但仍然达不到PCR的检测要求。

综上所述，开发一种更为高效、稳定、廉价的冬虫夏草药材分子鉴定方法成为亟需解决的问题，以适应市场及质检部门的检测需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速高效的DNA提取方法，旨在解决中药或食品检测领域常常由于样品类型、剂型繁多、添加辅料复杂而导致的DNA提取困难，并设计特异性的引物实现真菌类药材冬虫夏草及其商品的PCR分子鉴定。

本发明所采取的技术方案是：

一种检测冬虫夏草PCR引物，引物的核苷酸序列如下所示：

    

一种鉴别冬虫夏草真伪的PCR试剂盒，该试剂盒含有上面所述的引物。

一种鉴别冬虫夏草真伪的PCR方法，包括以下步骤：

1)从样品中提取DNA；

2)以提取的DNA为模板，用上面所述的引物对进行PCR扩增反应；

3)根据电泳条带的分布情况或添加染料，确定待测样品中冬虫夏草的真伪。