[发明专利]一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法和无血清培养基

权利要求书

1.一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，具体步骤包括：

步骤1，采集鳄鱼脂肪组织；

步骤2，将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞；

步骤3，将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养。

2.根据权利要求1所述的鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤2中将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞，具体为：

将步骤1得到的鳄鱼脂肪组织用生理盐水清洗3-5次，去除脂肪样本中的血丝，并将脂肪样本剪成1.0-1.2mm³的小块，放入50ml离心管中，体积为1.0-2.5ml；加入消化酶，消化酶与鳄鱼脂肪组织的体积比为2-6:1，37℃恒温摇床震荡消化50-70min，消化结束后，消化液经70μm滤网过滤，将滤液移入50ml离心管，1200rpm离心15-20min，移除上层黄色油脂和中间层消化液，收集沉淀并加入生理盐水冲洗1-2次，1500rpm离心7-8min，收集沉淀，即为鳄鱼脂肪干细胞。

3.根据权利要求2所述的鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，所述消化酶由0.1%I型胶原酶和0.25%胰酶/EDTA按体积比为2-5：1混合制成。

4.根据权利要求1-3任一项所述的鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤3中将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养，具体为：

鳄鱼脂肪干细胞沉淀中加入2ml无血清培养基重悬，接种于培养皿中，接种密度为0.8×10⁵个/ml-1.2×10⁵个/ml，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养，培养12-15天直至细胞融合率达到70％-80％，之后再进行传代培养。

5.根据权利要求4所述的鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，所述无血清培养基，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。

6.根据权利要求5所述的鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，所述转铁蛋白的浓度为0.3-40 μg/ml、所述血清白蛋白的浓度为0.3-4mg/ml、所述胰岛素的浓度为10-60ng/ml、所述大豆胰酶的浓度为0.5-40μg/ml、所述层粘连蛋白的浓度为0.05-4mg/ml、所述硒酸钠的浓度为0.5-30ng/ml、所述维生素C的浓度为20-50ng/ml和所述茶多酚的浓度为2.5-40μg/ml。

7.一种无血清培养基，其特征在于，包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。

8.根据权利要求7所述的无血清培养基，其特征在于，所述转铁蛋白的浓度为0.3-40 μg/ml、所述血清白蛋白的浓度为0.3-4mg/ml、所述胰岛素的浓度为10-60ng/ml、所述大豆胰酶的浓度为0.5-40μg/ml、所述层粘连蛋白的浓度为0.05-4mg/ml、所述硒酸钠的浓度为0.5-30ng/ml、所述维生素C的浓度为20-50ng/ml和所述茶多酚的浓度为2.5-40μg/ml。

9.根据权利要求7或8所述的无血清培养基，其特征在于，所述转铁蛋白的浓度为10-30μg/ml、所述血清白蛋白的浓度为1-3mg/ml、所述胰岛素的浓度为20-40ng/ml、所述大豆胰酶的浓度为10-30μg/ml、所述层粘连蛋白的浓度为0.2-3mg/ml、所述硒酸钠的浓度为2-20ng/ml、所述维生素C的浓度为30-40ng/ml和所述茶多酚的浓度为5-30μg/ml。

10.一种权利要求7-9任一项所述的无血清培养基在鳄鱼脂肪干细胞培养中的应用。