[发明专利]一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法和无血清培养基

说明书

本发明公开了一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，包括采集鳄鱼脂肪组织；将鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞；将鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养。本发明还公开了鳄鱼脂肪干细胞分离培养中所需的无血清培养基包括F12基础培养基，还包括转铁蛋白、血清白蛋白、胰岛素、大豆胰酶、层粘连蛋白、硒酸钠、维生素C和茶多酚。本发明鳄鱼脂肪干细胞细胞分离培养方法，细胞采用无血清培养基进行培养，无异源血清成分加入，避免了血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，减少了对细胞的伤害和后期临床使用时的风险。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法和无血清培养基。

背景技术

脂肪干细胞（Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs）是来源于脂肪组织中的具有不断的自我更新与多向分化潜能的间充质干细胞。脂肪干细胞为成纤维细胞样，脂肪干细胞低表达HLA-ABC，而不表达HLA-DR，从而说明ADSCs具有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，均不会发生免疫排斥反应，在一定条件下，可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞和成骨细胞分化，脂肪干细胞的基本形态、增殖周期、免疫周期、免疫原性及多向分化潜能与目前研究较多的骨髓间充质干细胞相似。

ADCSs取自于脂肪组织，具有来源广泛、取材简单、培养成功率高、细胞老化率低等优点，引起研究者的广泛关注，逐渐成为组织工程学的理想种子细胞。

目前分离培养组织干细胞的培养基通常为含有牛血清或人血清的DMEM/F12完全培养基，而血清可能存在对细胞的毒性作用和血清源性污染等缺陷。且目前还未有见对鳄鱼脂肪干细胞的分离培养相关的报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，解决了现有脂肪干细胞的分离培养采用血清培养基，可能对细胞存在毒性作用和血清源性污染的问题。

本发明的另一个目的是提供一种无血清培养基。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种鳄鱼脂肪干细胞分离培养方法，具体步骤包括：

步骤1，采集鳄鱼脂肪组织；

步骤2，将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞；

步骤3，将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养。

进一步地，步骤2中将步骤1得采集到的鳄鱼脂肪组织经过清洗、消化得到鳄鱼脂肪干细胞，具体为：

将步骤1得到的鳄鱼脂肪组织用生理盐水清洗3-5次，去除脂肪样本中的血丝，并将脂肪样本剪成1.0-1.2mm³的小块，放入50ml离心管中，体积为1.0-2.5ml；加入消化酶，消化酶与鳄鱼脂肪组织的体积比为2-6:1，37℃恒温摇床震荡消化50-70min，消化结束后，消化液经70μm滤网过滤，将滤液移入50ml离心管，1200rpm离心15-20min，移除上层黄色油脂和中间层消化液，收集沉淀并加入生理盐水冲洗1-2次，1500rpm离心7-8min，收集沉淀，即为鳄鱼脂肪干细胞。

进一步地，消化酶由0.1%I型胶原酶和0.25%胰酶/EDTA按体积比为2-5：1混合制成。

进一步地，步骤3中将步骤2得到的鳄鱼脂肪干细胞用无血清培养基进行培养，具体为：

鳄鱼脂肪干细胞沉淀中加入2ml无血清培养基重悬，接种于培养皿中，接种密度为0.8×10⁵个/ml-1.2×10⁵个/ml，在37℃、5％二氧化碳培养箱中进行培养，培养12-15天直至细胞融合率达到70％-80％，之后再进行传代培养。