[发明专利]二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用

权利要求书

1.一种二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，其特征在于，包括奶牛乳腺上皮细胞对数生长期细胞的培养、奶牛乳腺上皮细胞热应激处理、热应激处理后细胞存活率检测以及二氢杨梅素对奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤的调控验证，具体包括以下步骤：

A奶牛乳腺上皮细胞对数生长期细胞的培养

①取液氮冻存的奶牛乳腺上皮细胞系1mL，37℃水浴复苏后常规培养，以细胞培养基DMEM/F12加10％体积分数的胎牛血清作为完全培养基，于37℃、5％的CO₂培养箱中培养，每隔2～3天更换培养基或传代培养，取对数生长期细胞用于后续试验；

B奶牛乳腺上皮细胞热应激处理

①用0.25％的胰蛋白酶消化收集上述步骤A中对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，细胞计数板计数后，制备成1×10⁴个/mL的细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔接种200μL，接种两板，同时置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养24h；

②培养结束后将每板随机各分为5个试验组，每组5个重复，向各个试验组中分别加入含0μΜ、5μΜ、10μΜ、25μΜ及50μΜ的二氢杨梅素完全培养基200μL继续于37℃、5％的CO₂培养箱中预处理12h；

③将上述步骤②中处理后的两板细胞，随机分为两组，其中1板转入42℃、5％的CO₂培养箱中高温培养2h，引起热应激反应；另一板继续于37℃、5％的CO₂培养箱中正常培养2h；

C热应激处理后细胞存活率检测

①向上述步骤B中热应激处理结束后的两个培养板中每孔加入10μLCCK-8溶液，并于37℃、5％的CO₂培养箱孵育1h，全波长酶标仪测定各孔在激发波长为490nm处的吸光度OD值，分别计算每组细胞存活率，

细胞存活率＝试验组OD值/对照组OD值×100％

其中，选取37℃、5％的CO₂培养箱中培养且二氢杨梅素物质的量浓度为0μΜ的组别为对照组，对照组的细胞存活率定义为100％；

D二氢杨梅素对奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤的调控验证

①根据上述步骤C的细胞存活率检测结果，选择二氢杨梅素物质的量浓度25μΜ为作用浓度，用0.25％的胰蛋白酶消化收集上述步骤A中对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，细胞计数板计数后，制备成1×10⁵个/mL的细胞悬液，并接种于6孔细胞培养板中，每孔2mL，接种两板，同时置于37℃、5％的CO₂培养箱中培养24h后，建立以下4组试验：

a、对照组，将细胞板放置于37℃条件下正常培养2h；

b、二氢杨梅素模型组，向细胞板中添加25μΜ的二氢杨梅素，并放置于37℃条件下正常培养2h；

c、热应激模型组，将细胞板放置于42℃高温条件下培养2h；

d、热应激挽救组，向细胞板中添加25μΜ二氢杨梅素，并放置于42℃高温条件下培养2h；

②采用流式细胞术检测上述4个试验组中乳腺上皮细胞凋亡百分数；

③采用荧光定量PCR即RT-qPCR检测HSP70、Bax和Bcl-2mRNA表达量；

④采用蛋白免疫印迹法即Western blot检测HSP70和Bax的蛋白表达丰度。

2.根据权利要求1所述的二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，其特征在于，所述全波长酶标仪型号为Bio-Tek。

3.根据权利要求1所述的二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，其特征在于，所述流式细胞术检测包括以下步骤：

a、用不含EDTA的0.25％的胰蛋白酶消化收集上述步骤D中4个试验组细胞，转移至离心管中，300g离心5min，弃上清液；

b、弃上清液后每组加入1mL 4℃预冷的PBS洗涤，相同条件离心弃上清后，每组加100μL的1×BindingBuffer重悬细胞；

c、转入流式管，依次加5μLAnnexinV-FITC和5μLPI Staining Solution，轻轻混匀，避光、室温反应10min，加入400μL 1×Binding Buffer，混匀，1h内用流式细胞仪检测。