[发明专利]二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用

说明书

本发明公开了一种二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，包括奶牛乳腺上皮细胞对数生长期细胞的培养、奶牛乳腺上皮细胞热应激处理、热应激处理后细胞存活率检测以及二氢杨梅素对奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤的调控验证。本发明致力于阐明二氢杨梅素对高温诱导奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤的拮抗作用和机制，有助于深入了解高温环境对正常奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤和二氢杨梅素拮抗细胞凋亡的作用机理及内在联系。

技术领域

本发明涉及一种二氢杨梅素的应用，具体为一种二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，属于奶牛乳腺上皮细胞热应激应用领域。

背景技术

随着产业集约化发展及全球气候变暖，热应激导致奶牛泌乳性能降低已成为亟需解决的难题。大部分奶牛耐寒怕热，汗腺机能不发达，散热能力差，且产奶过程又产生大量的代谢热，导致其对高温环境尤为敏感。有研究表明，高温引起奶牛热应激直接导致产奶量和乳品质降低，降幅达20%～45%，造成奶牛业严重的经济损失。

乳腺是乳汁合成的场所，其泌乳能力高低取决于乳腺上皮细胞的数量及状态。高温条件下，乳腺上皮细胞发生氧化应激，引起细胞程序性死亡（凋亡、自噬），并影响相应信号通路转导和泌乳关键基因表达，从而降低奶牛泌乳性能。由此可见，减少奶牛乳腺上皮细胞凋亡，维持乳腺泌乳功能正常，是防止夏季奶牛泌乳性能降低的关键。

中草药及其活性成分作为抗应激饲料添加剂中重要一员，被广泛报道。二氢杨梅素(DMY, Dihydromyricetin)，是葡萄科蛇葡萄属的一种野生木质藤本植物提取物，其主要成分为黄酮类化合物，具有多种药理作用，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗高血压或保护肝脏等。有研究报道，二氢杨梅素可通过降低血管紧张素诱导的活性氧（ROS）和丙二醛(MDA)水平，并增加总抗氧化功能。此外，二氢杨梅素也可通过线粒体凋亡途径保护人脐静脉内皮细胞不受H₂O₂诱导的氧化应激和凋亡的影响。基于二氢杨梅素的这些抗氧化功能，我们猜测二氢杨梅素对高温诱导的奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤具有潜在的调控作用。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种二氢杨梅素在拮抗奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤中的应用，包括奶牛乳腺上皮细胞对数生长期细胞的培养、奶牛乳腺上皮细胞热应激处理、热应激处理后细胞存活率检测以及二氢杨梅素对奶牛乳腺上皮细胞热应激损伤的调控验证，具体包括以下步骤：

A奶牛乳腺上皮细胞对数生长期细胞的培养

①取液氮冻存的奶牛乳腺上皮细胞系1 mL，37℃水浴复苏后常规培养，以细胞培养基DMEM/F12加10%体积分数的胎牛血清作为完全培养基，于37℃、5%的CO₂培养箱中培养，每隔2～3天更换培养基或传代培养，取对数生长期细胞用于后续试验；

B奶牛乳腺上皮细胞热应激处理

①用0.25%的胰蛋白酶消化收集上述步骤A中对数生长期奶牛乳腺上皮细胞，细胞计数板计数后，制备成1×10⁴个/mL的细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔接种200μL，接种两板，同时置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养24 h；

②培养结束后将每板随机各分为5个试验组，每组5个重复，向各个试验组中分别加入含0μΜ、5μΜ、10μΜ、25μΜ及50μΜ的二氢杨梅素完全培养基200 μL，继续于37℃、5%的CO₂培养箱中预处理12 h；

③将上述步骤②中处理后的两板细胞，随机分为两组，其中1板转入42℃、5%的CO₂培养箱中高温培养2 h，引起热应激反应；另一板继续于37℃、5%的CO₂培养箱中正常培养2h；