[发明专利]一种基于氧化石墨烯纳米靶向载体复合物的Caspase-3荧光检测方法

权利要求书

1.一种基于氧化石墨烯GO纳米靶向载体复合物的Caspase-3荧光检测方法，其特征通过在GO表面修饰靶向识别分子和荧光素FAM标记的Caspase-3特异识别肽段制备GO纳米靶向载体复合物，Caspase-3存在时导致底物肽段的切割FAM从GO表面脱落荧光恢复；实验首先用FAM标记的Caspase-3特异性底物肽Pep，其序列为CALNNDEVDK-FAM、壳聚糖CS和Toll样受体4抗体蛋白Anti-TLR4共价修饰于GO表面，构建适用于凋亡中关键节点蛋白Caspase-3活性检测的GO纳米靶向载体复合物GO/CS/Pep/Anti-TLR4；当活性的Caspase-3存在时，Caspase-3识别GO/CS/Pep/Anti-TLR4上Pep含有的DEVD序列肽段并进行特异性切割，导致FAM从GO表面脱落，FAM荧光恢复，通过荧光分光光度计检测荧光强度，绘制Caspase-3浓度与荧光强度之间的标准关系曲线，依据检测所得荧光强度计算实际样品中Caspase-3浓度。

2.根据权利要求1所述的一种基于GO纳米靶向载体复合物的Caspase-3荧光检测方法，其特征是通过在GO表面修饰靶向识别分子和荧光素FAM标记的Caspase-3特异识别肽段制备GO纳米靶向载体复合物，Caspase-3存在时导致底物肽段的切割FAM从GO表面脱落荧光恢复。

3.根据权利要求1所述的一种基于GO纳米靶向载体复合物的Caspase-3荧光检测方法，其特征是首先用FAM标记的Caspase-3特异性底物肽Pep、壳聚糖CS和Toll样受体4抗体蛋白Anti-TLR4共价修饰于GO表面，构建适用于凋亡中关键节点蛋白Caspase-3活性检测的GO纳米靶向载体复合物即GO/CS/Pep/Anti-TLR4，试验首先取50mg的GO粉末加入25mL三蒸水制成悬浮液，将悬浮液在400Hz的细胞破碎仪中超声分散3h制备成浓度为2mg/mL的GO溶液；在超声状态下逐渐加入300μL含45mg EDC和25mg NHS的溶液活化4h，25mL 1mg/mL的CS溶液超声1h后，在室温下磁力搅拌24h，4 000g 30min下超滤3次，用双蒸水溶解成1mg/mL GO/CS溶液；取40mL GO/CS溶液，加入300μL含10mg EDC和5mg NHS的溶液活化3h，用1mM NaOH将活化后的GO/CS溶液pH调至8.0，再加100μL含2mg Pep和10μL 0.6mg/mL的Anti-TLR4溶液，室温下避光搅拌反应24h，超滤3次除去多余的物质纯化产物，用双蒸水溶解成1mg/mL的GO纳米载体复合物GO/CS/Pep/Anti-TLR4溶液置于4℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种基于GO纳米靶向载体复合物的Caspase-3荧光检测方法，其特征是活性的Caspase-3存在时，Caspase-3识别GO/CS/Pep/Anti-TLR4上Pep含有的DEVD序列肽段并进行特异性切割，导致FAM从GO表面脱落，FAM荧光恢复，通过荧光分光光度计检测荧光强度，实验用pH值为7.4的含6mM HEPES、10mM DTT、100mM NaCl、1mM EDTA、0.1％w/vCHAPS和10％v/v甘油反应缓冲液将权利要求3中的GO/CS/Pep/Anti-TLR4溶液稀释成0.01mg/mL以及将Caspase-3粉末溶解稀释成0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0和8.0U/mL，分别取100μL 0.01mg/mLGO/CS/Pep/Anti-TLR4与100μL不同浓度的Caspase-3 37℃孵育60min，使用荧光分光光度计记录FAM的荧光光谱，参数设置：激发波长为450nm，发射波长为460～650nm，狭缝设定为5.0nm。

5.根据权利要求1所述的一种基于GO纳米靶向载体复合物的Caspase-3荧光检测方法，其特征是通过荧光分光光度计检测荧光强度，绘制Caspase-3浓度与荧光强度之间的标准关系曲线，依据检测所得荧光强度计算实际样品中Caspase-3浓度。