[发明专利]一种基于氧化石墨烯纳米靶向载体复合物的Caspase-3荧光检测方法

说明书

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种基于氧化石墨烯(GO)纳米靶向载体复合物的Caspase‑3荧光检测方法。本发明主要是在GO表面修饰靶向识别分子和荧光素(FAM)标记的Caspase‑3特异识别肽段制备GO纳米靶向载体复合物，Caspase‑3会引起底物肽段被切割FAM从GO表面脱落荧光恢复。实验用FAM标记的Caspase‑3特异性底物肽(Pep)、壳聚糖(CS)和Toll样受体4抗体蛋白(Anti‑TLR4)共价修饰于GO表面，构建用于凋亡关键节点蛋白Caspase‑3检测的GO纳米靶向载体复合物(GO/CS/Pep/Anti‑TLR4)；Caspase‑3存在时会识别GO/CS/Pep/Anti‑TLR4上Pep含有的序列肽段并特异性切割，FAM从GO表面脱落荧光恢复，通过荧光分光光度计检测荧光强度，绘制Caspase‑3浓度与荧光强度之间的标准关系曲线，依据检测所得荧光强度计算实际样品中Caspase‑3浓度。该方法灵敏性高、特异性强。

技术领域

本发明涉及一种多Caspase-3的检测方法，特别是一种基于氧化石墨烯纳米靶向载体复合物的Caspase-3荧光检测方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

半胱天冬酶(Caspase)是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活与表达均能引起细胞凋亡，生物活性对凋亡形态变化至关重要。Caspase属于自催化半胱氨酸蛋白酶家族，能够调节许多细胞过程，包括凋亡，细胞分化和炎症。在细胞凋亡中Caspase分为上游引发剂Caspase及其底物，下游刽子手Caspase及其底物两种类型。Caspase-3是细胞凋亡的关键执行者之一，处于凋亡级联反应的下游，通常作为同源二聚体存在，需要在亚基的连接处进行切割以实现完全活化。作为刽子手的Caspase-3主要在凋亡和其他细胞蛋白水解级联中起作用，导致DNA 片段化和多种细胞底物的降解，是多种凋亡信号传递的汇聚点。

新兴趋势表明，碳纳米材料具有尺寸小、比表面积大、能与组织细胞相互作用等优势在药物输送，生物成像、基因和癌症治疗等方面具有广泛的应用前景。氧化石墨烯(GO)独特的结构和性质在各个领域得到国内外学者的关注特定序列的检测在生物医药、基因治疗以及临床检验等研究领域均有重要作用。GO接有大量含氧基团，平面上含有-OH和C-O-C，而在其片层边缘含有C＝O和COOH这些基团与各种聚合物、金属和生物分子通过酰胺化、酯化作用及加成反应修饰到羧化CNTs的表面主要包括酰胺化、酯化作用和加成反应等化学反应。与原始氧化石墨烯相比，功能化的碳纳米材料具备了更高的分散性和生物相容性，对组织细胞的毒性较低。因此，功能化碳纳米材料的研究在生物学领域开辟了一个全新方向。

现今检测Caspase-3常用的方法有免疫细胞化学、流式细胞仪术、Western Blot免疫沉淀、荧光定量PCR法、Caspase-3活性检测试剂盒等。这些检测方法往往需要昂贵的仪器，同时需要对催化底物进行放射性标记或酶标记。而该方法具有的设备简单，灵敏度高、特异性好、有效等优点。因此一种快速、灵敏的Caspase-3活性检测方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的通过在GO表面修饰靶向识别分子和荧光素(FAM)标记的Caspase-3特异识别肽段制备GO纳米靶向载体复合物，Caspase-3存在时切割底物肽段导致FAM从GO表面脱落荧光恢复的原理，建立一种有效而又具有极高灵敏度的Caspase-3的检测方法。