[发明专利]一种同时检测多种细菌性病原微生物的方法

权利要求书

1.一种同时检测多种细菌性病原微生物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)将多种细菌性病原微生物的核糖体16S RNA进行序列比对；

(2)根据比对结果确定多种细菌16S RNA的保守序列并设计通用引物，将下游通用引物5'端用生物素标记得到；通过PCR扩增获得带有生物素标记的多种菌株DNA混合片段；

(3)根据比对寻找每种细菌特有的基因片段并分别设计特异性探针以及与各特异性探针配合的通用探针，将探针5'端连接氨基团，将修饰氨基团的探针通过化学反应共价结合在带负电的尼龙膜；

(4)将带有生物素标记的多种菌株DNA混合片段与固定在尼龙膜上的探针杂交，用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶和免疫印迹发光氨试剂孵育后，在暗室曝光将结果显影在胶片上，获得菌株检测结果。

2.如权利要求1所述的同时检测多种细菌性病原微生物的方法，其特征在于，所述多种细菌性病原微生物为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、福氏志贺菌(Shigellaflexneri)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、鼠伤寒肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella enterica subsp.entericaserovar typhimurium)、变形杆菌(Proteus vulgaris)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocoliticasubsp.enterocolitica)。

3.如权利要求2所述的同时检测多种细菌性病原微生物的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述通用引物包括为：

上游通用引物RLB-F：5'-AGYGGCGGACGGGTGAGTAA-3'，

下游通用引物RLB-R：5'-CCATTGTAGCACGTGTGTAGCCC-3'；

其中，引物RLB-F中的Y为A、T、G、C中的任一碱基。

4.如权利要求2所述的同时检测多种细菌性病原微生物的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述通用探针为：

Cat-all-1：5'-GACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3'，

Cat-all-2：5'-CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3'；

所述特异性探针包括：

Staphyloco-1：5'-TCAAAAGTGAAAGACGGTCTTGC-3'，

Staphyloco-2：5'-CAACATATGTGTAAGTAACTGTGCAC-3'；

S.flexneri-1：5'-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGC-3'，

S.flexneri-2：5'-CTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGT-3'；

A.caviae-1：5'-CGAGGAGGAAAGGTCAGTAGC-3'，

A.caviae-2：5'-GGAATCAGAACACAGGTGCT-3'；

V.vulnificus：5'-AGAGAATTCTAGCGGAGACGCG-3'；

S.enterica：5'-AGAAGAATCCAGAGATGGATTG-3'；

P.vulgaris-1：5'-GGTGATAAAGTTAATACCTTTGTCAA-3'，

P.vulgaris-2：5'-CGAATCCTTTAGAGATAGAGGA-3'；

Y.enterocolitica subsp-1：5'-GGCCAATAACTTAATAGGTTG-3'；

Y.enterocolitica subsp-2：5'-AGAACTTAGCAGAGATGCTTCG-3'。