[发明专利]一种同时检测多种细菌性病原微生物的方法

说明书

本发明公开了一种同时检测多种细菌性病原微生物的方法，该方法包括以下步骤：将多种细菌性病原微生物的核糖体16S RNA进行序列比对；根据比对确定的保守序列设计通用引物，对下游通用引物5'端用生物素标记，通过PCR扩增获得带有生物素标记的DNA片段；根据比对确定特异片段并分别设计特异性探针以及通用探针，将修饰氨基团的探针通过化学反应共价结合在带负电的尼龙膜；将DNA片段与固定在尼龙膜上的探针杂交，用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶和免疫印迹发光氨试剂孵育后，在暗室曝光将结果显影在胶片上，获得菌株检测结果。本发明方法可以快速、高效、大通量的检测人、畜细菌性感染的情况，极大的节约检测成本和检测时间。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种同时检测蝇媒携带的7种细菌性病原微生物的反向线状印迹杂交检测技术。

背景技术

反向线状杂交技术是一种敏感的高通量检测方法。1988年由Saiki等人发明并用于镰刀形细胞贫血症和β-地中海贫血的检测中，通过报道可以发现，该方法原则上能区分一个碱基的差别，其原理是将带有生物素(biotion)标记的PCR产物单链与固定在尼龙膜(C，0.45μm)上的特异性寡核苷酸探针杂交，通过链霉亲和素过氧化物酶(streptavidin peroxidase)和显色剂结合，得到化学显色信号，再由胶片曝光直观地判读结果。该方法自报道以后就广泛应用于各种分子生物学检测中如将该项技术用于结核分枝杆菌菌株的区分、埃里希体属病原的检测与鉴别、乙肝病毒分型和耐药突变检测中，并评价该技术在乙肝基因分型的特异性和灵敏性。由于PCR-RLB技术的高特异性、灵敏性和准确性该技术越来越多的应用到各种寄生虫、细菌、病毒的鉴别和分类以及位点突变的研究中，然而该技术的仅能进行一种细菌或病毒的检测与分型，无法做到混合感染病例的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测蝇媒携带的7种细菌性病原微生物的方法，旨在解决上述背景技术中所描述存在的问题。

本研究发明一种高效、快捷，同时确保准备性能够同时检测多种细菌感染的方法反向线状杂交技术更好的控制虫媒病传播。

本发明是这样实现的，一种同时检测多种细菌性病原微生物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将多种细菌性病原微生物的核糖体16S RNA进行序列比对；

(2)根据比对结果确定多种细菌16S RNA的保守序列并设计通用引物，将下游通用引物5'端用生物素标记得到；通过PCR扩增获得带有生物素标记的多种菌株DNA混合片段；

(3)根据比对寻找每种细菌特有的基因片段并分别设计特异性探针以及与各特异性探针配合的通用探针，将探针5'端连接氨基团，将修饰氨基团的探针通过化学反应共价结合在带负电的尼龙膜；

(4)将带有生物素标记的多种菌株DNA混合片段与固定在尼龙膜上的探针杂交，用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶和免疫印迹发光氨试剂孵育后，在暗室曝光将结果显影在胶片上，获得菌株检测结果。

优选地，所述多种细菌性病原微生物为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、鼠伤寒肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella entericasubsp.entericaserovar typhimurium)、变形杆菌(Proteus vulgaris)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica subsp.enterocolitica)。

优选地，在步骤(2)中，所述通用引物包括为：

上游通用引物RLB-F：5'-AGYGGCGGACGGGTGAGTAA-3'，