[发明专利]肝癌阴离子标志物的筛选方法和应用

权利要求书

1.一种肝癌阴离子标志物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一步，提取待检样本中的代谢混合物，备用；所述待检样本包括肝癌样本和肝硬化样本；代谢混合物的提取方法为：将样本组织用4℃预冷的PBS溶液清洗两次后，加入超纯水匀浆，涡旋，加入提取液后再次涡旋，低温超声破碎，沉淀，离心，冷冻干燥得到代谢混合物；提取液为体积比=1:1的甲醇和乙腈混合液；

第二步，将第一步得到的代谢混合物用液相色谱进行分离，分离后的样品用质谱仪鉴定分析，采集质谱数据；

高效液相分离条件为：流动相A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，流动相B：乙腈；梯度洗脱条件为：梯度洗脱程序如下：0～0.5min：95%流动相B；0.5～7min：流动相B从95%线性变化至65%，7～8min：流动相B从65%线性变化至40%，8～9min：流动相B维持在40%，9～9.1min：流动相B从40%线性变化至95%，9.1～12min：流动相B维持在95%；

质谱仪I采集数据，其检测条件为：ESI源条件如下：气体温度：250℃，干燥气体：16L/min，Nebulizer喷雾器：20psig，鞘气体温度：400℃，鞘气体流速：12L/min，Vcap升压电容负极：3000V，喷嘴电压：0V；碎裂电压：175V，质量范围：50-1200，采集速率：4HZ，循环时间：250ms；

采用质谱仪II进行鉴定，质谱条件为：离子源气体1：40，离子源气体2：80，气帘气：30，离子源温度：650℃，离子喷雾电压：-5000V，负离子模式；二级质谱采用高灵敏度模式采集模式获得，去集群电势：±60V，负离子模式；碰撞能量：35±15eV，IDA的排除同位素参数设置为4Da，每个周期要监测的候选离子：10；质谱数据采集按50-300，290-600，590-900，890-1200分段采集；

第三步，将第二步得到的质谱数据采用精确质量数匹配25ppm和二级谱图匹配的方式确定代谢混合物中的每种代谢物质；

第四步，以变量权重值1为筛选标准，用OPLS-DA对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选；初筛出肝癌样本与肝硬化样本之间的差异代谢物质后，用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出肝癌样本与肝硬化样本之间的显著性差异代谢物质即为肝癌阴离子标志物；肝癌阴离子标志物包括酮异己酸阴离子、2,4-硝基苯酚阴离子、4-壬基酚阴离子和异丁酸阴离子。

2.样本组织中的酮异己酸阴离子、2,4-硝基苯酚阴离子、4-壬基酚阴离子和异丁酸阴离子作为肝癌阴离子标志物在制备肝癌诊断试剂盒或诊断药物中的应用。