[发明专利]肝癌阴离子标志物的筛选方法和应用

说明书

本发明公开了一种肝癌阴离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：第一步，提取待检样本中的代谢混合物，备用；第二步，将第一步得到的代谢混合物用液相色谱进行分离，分离后的样品用质谱仪鉴定分析，采集质谱数据；第三步，确定代谢混合物中的每种代谢物质；第四步，筛选出肝癌样本与肝硬化样本之间的显著性差异代谢物质即为肝癌阴离子标志物。本发明首次建立了一种与肝癌诊断相关阴离子标志物的筛选方法，筛选出酮异己酸阴离子、2,4‑硝基苯酚阴离子、4‑壬基酚阴离子和异丁酸阴离子四个显著性差异小分子，为日后肝癌药物的研发提供新的靶点和思路，具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种肝癌阴离子标志物的筛选方法，还涉及筛选出的肝癌阴离子标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用。

背景技术

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，即HCC），是一种高死亡率的原发性肝癌，它是一种全球范围最常见的恶性肿瘤，尤其是在亚洲、非洲和南部欧洲。全球每年新发病例数约65万，其发病率占所有恶性肿瘤的第5位，死亡数约为60万，为所有恶性肿瘤的第3位。在我国，肝癌的发生主要与乙型肝炎相关，每年的新发病例占全世界新发病例的55%左右。

肝癌早期症状不明显，具有进展迅速、易早期转移的特点，在临床上存在早诊困难、预后效果差的问题。目前，临床上的肝癌筛查方法是B型超声显像（即B超）、肿瘤标志物甲胎蛋白（α-fetoprotein，即AFP）的血清含量或两者结合进行筛查。然而，B超很难鉴别小肝癌或肝硬化结节，而甲胎蛋白血清水平在诊断肝癌时存在敏感性和特异性较低的缺陷，单独用于确诊时的检出率一般只有50％—75％左右。现有筛查方法的局限性极大地限制了肝细胞癌的早期有效诊断，预警作用有限。对于肝细胞癌的早期有效诊断有助于显著提高患者的生存率，因此，开发具有临床早诊潜力的新方法对于降低肝细胞癌的发病率和死亡率具有非常重要的现实意义。

近年来，代谢组学技术作为一个新的有力工具，被广泛运用于疾病研究中。将疾病状态下异常的或者数量变化极大的代谢小分子作为标志物，以用于诊断疾病的进程具有重要意义。质谱技术是代谢组学的主要研究手段，其检测小分子代谢物在疾病诊断中的应用已有成功的案例，包括基于检测多种氨基酸的新生儿疾病筛查、检测肌氨酸的前列腺癌判别等。但目前还未有关于小分子代谢物阴离子作为由肝癌筛查相关的标志物的报道。

发明内容

本发明提供了一种肝癌阴离子标志物的筛选方法，还涉及筛选出的肝癌阴离子标志物在制备肝癌诊断药物或诊断试剂盒中的应用，对肝癌的筛查具有重要意义，为日后肝癌的诊断乃至治疗药物的研发提供了新的靶点和思路。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：

本发明提供了一种肝癌阴离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：

第一步，提取待检样本中的代谢混合物，备用；所述待检样本包括肝癌样本和肝硬化样本；

第二步，将第一步得到的代谢混合物用高效液相色谱进行分离，分离后的样本用质谱仪鉴定分析，采集代谢混合物的质谱数据；

第三步，将第二步得到的质谱数据转换成.mzXML格式，采用精确质量数匹配25ppm和二级谱图匹配的方式确定代谢混合物中的每种代谢物质；

第四步，以变量权重值1为筛选标准，用OPLS-DA对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选，初筛出肝癌样本与肝硬化样本之间的差异代谢物质，差异代谢物质的变量权重值1，且差异倍数2或0. 5；用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出肝癌样本与肝硬化样本之间的显著性差异代谢物质（P值0.05）即为肝癌阴离子标志物，即酮异己酸阴离子、2,4-硝基苯酚阴离子、4-壬基酚阴离子和异丁酸阴离子。

优选地，第一步中代谢混合物的具体提取方法为：将样本组织用4℃的PBS溶液清洗两次后，加入超纯水破碎匀浆，涡旋，加入提取液后再次涡旋，低温超声提取，沉淀，离心，冷冻干燥得到代谢混合物，将代谢混合物于-80℃下冷冻冻存，备用。