[发明专利]肝硬化阳离子标志物的筛选方法和应用

权利要求书

1.一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一步，样本提取：将待测样本用4°C预冷的PBS清洗2次，加入超纯水匀浆，涡旋，加入提取液，涡旋，超声破碎2次，沉淀，离心，将上清冷冻干燥后得到代谢混合物，备用；提取液为体积比=1:1的甲醇和乙腈混合液；

第二步，利用LC-MS/MS分离并采集质谱数据：用高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；

高效液相色谱检测条件为：流动相流速为300nL/min，流动相由A、B两相组成，流动相A是含25 mM氨水和25 mM乙酸铵的水溶液，流动相B是乙腈；采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0~0.5 min，95%流动相B；0.5~7min，95%~65%流动相B；7~8 min，65%~40%流动相B；8~9 min，40%流动相B；9~9.1 min，40%~95%流动相B；9.1~12 min，95%流动相B；

质谱仪Ⅰ的ESI源设置参数为：气体温度为250°C，干气体流速为16 L/min，鞘气温度为400°C，鞘气流速为12 L/min，Nozzle喷嘴电压为175 V，喷雾器为20 psig，Vcap升压电容正极为3000 V，质量范围为50~1200道尔顿，数据采集速率为4 HZ，每个循环的时间为50ms；

质谱仪Ⅱ的ESI源设置参数为：离子源温度：650°C，离子源气体1：40，离子源气体2：80，离子源温度：650°C，气帘气：30，离子喷嘴电压：+5000 V，正离子模式；二级谱图采用高灵敏度模式进行采集，分布势能：±60 V，正离子模式，碰撞能量：35±15 eV，IDA的参数设置如下：排除同位素的质量范围：4道尔顿，每个周期监测的候选离子：10，按照质核比范围进行分段采集：50~300m/z，290~600 m/z，590~900 m/z，890~1200 m/z；

第三步，确定代谢物质：将第二步得到的质谱数据转化为.mzXML格式，然后采用lc-msspectra annotation进行峰对齐、保留时间校正以及峰面积的提取，采用精确质量数匹配25ppm和二级谱图匹配的方式确定每种代谢物质；

第四步，筛选显著性差异代谢物质：用多变量统计对第三步确定的每种代谢物质进行初步筛选；初筛出肝硬化样本与正常样本之间的差异代谢物质后，用单变量统计对初筛得到的差异代谢物质再次筛选，筛选出肝硬化样本与正常样本之间的显著性差异代谢物质即为肝硬化阳离子标志物；显著性差异代谢物质包括酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子。

2.样本组织中的酪胺阳离子、2-苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子和Val-Ile阳离子的组合物作为肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断试剂盒或诊断药物中的应用。