[发明专利]肝硬化阳离子标志物的筛选方法和应用

说明书

本发明公开了一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：第一步，样本提取；第二步，利用LC‑MS/MS分离并采集质谱数据：用高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；第三步，确定代谢物质；第四步，筛选显著性差异代谢物质。本发明首次建立了一种与肝硬化诊断相关阳离子标志物的筛选方法，筛选得到的酪胺阳离子、2‑苯乙酰胺阳离子、三乙醇胺阳离子、Val‑Ile阳离子的组合以及2‑苯乙酰胺阳离子可以作为肝硬化诊断的新的标志物，为日后的肝硬化诊断药物的研发提供新的靶点和思路，具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，还涉及筛选出的肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断药物或诊断试剂盒中的应用。

背景技术

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，即HCC），是一种高死亡率的原发性肝癌，它是一种全球范围最常见的恶性肿瘤，尤其是在亚洲、非洲和南部欧洲。全球每年新发病例数约65万，其发病率占所有恶性肿瘤的第5位，死亡数约为60万，为所有恶性肿瘤的第3位。

肝癌的发病原因多种多样，目前我国肝癌主要在乙肝肝硬化或非酒精性脂肪性肝炎所致肝硬化的基础上发展而来。即病毒性肝炎、肝硬化是肝细胞癌发生的主要病理基础。大多数的肝癌患者伴有肝硬化，从肝炎、肝硬化到肝癌，其形态改变往往是连续的。研究表明，肝细胞癌的发生大多是经历了一个从病毒性肝炎→肝硬化→肝癌的复杂过程。在肝硬化→肝癌的恶变进程中，会经历一个较长的肝癌癌前病变过程。肝癌癌前病变是良性病变向恶性病变过渡的移行阶段，是一类具有细胞不典型性和分化异常的增生性病变，持续时间较长。目前，肝硬化增生结节是一重要的癌前病变并已得到公认，因而，对肝硬化研究和认识的提高有助于早期肝癌的发现和治疗。但目前，对早期肝硬化的诊断主要依赖于超声和组织活检，超声技术的敏感性和特异性均不是很高，组织活检技术主要依赖于病理切片诊断，但其高费用、活检局限性（主要包括样本误差以及不同阅片者之间的偏倚等），促使人们开始寻找一种替代方法。

近年来，代谢组学技术作为一个新的有力工具，被广泛运用于疾病研究中。将疾病状态下异常的或者数量变大化极大的代谢小分子作为标志物，以用于诊断疾病的进程具有重要意义。液相色谱-质谱串联技术是代谢组学的主要研究手段，前列腺癌的诊断标志物肌氨酸的检测、新生儿疾病筛查时的多种氨基酸检测等均是代谢小分子在疾病诊断中应用的已有成功案例。由于多种因素可影响机体的代谢状态，导致单一代谢物容易收到扰动，因此从众多代谢物中优选出由少数代谢物组成的“联合型代谢标志物”，并以判别公式计算“判别可能性”P 值（Probability），能够显著改善代谢物对疾病诊断的灵敏度以及特异性。

发明内容

本发明提供了一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，还涉及筛选出的肝硬化阳离子标志物在制备肝硬化诊断药物或诊断试剂盒中的应用，为日后肝硬化以及肝癌药物的研发提供了新的靶点和思路，对肝硬化的诊断和以及肝癌的预防具有重要意义。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：

本发明提供了一种肝硬化阳离子标志物的筛选方法，包括以下步骤：

第一步，样本提取：将待测样本用4℃预冷的PBS清洗2次，加入超纯水匀浆，涡旋，加入提取液，涡旋，超声破碎2次，沉淀，离心，将上清冷冻干燥后得到代谢混合物，备用；

第二步，利用LC-MS/MS分离并采集质谱数据：用高效液相色谱分离第一步中得到的代谢混合物，将分离后的样品用质谱仪Ⅰ进行检测分析，用质谱仪Ⅱ采集样品的一级谱图和二级谱图；