[发明专利]缺氧诱导因子-2α作为作用靶点在帕金森病预防/治疗中的应用

权利要求书

1.缺氧诱导因子-2α作为作用靶点在帕金森病的预防/治疗中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

应用6-OHDA分别处理原代培养的中脑星形胶质细胞和原代培养的中脑腹侧神经元，分别检测提取的总蛋白中的HIF-1α和HIF-2α的蛋白表达，并分别与未利用6-OHDA处理组中的HIF-1α和HIF-2α的蛋白表达进行比较，检测得到6-OHDA激活星形胶质细胞中的HIF-1α和HIF-2α，而没有激活中脑腹侧神经元细胞中的HIF-1α和HIF-2α，确定6-OHDA制备的帕金森病细胞模型中，6-OHDA激活原代培养的中脑星形胶质细胞HIF-1α和HIF-2α；

使用HIF-1α特异性抑制剂Bay87-2243作用于原代培养的中脑星形胶质细胞后，与6-OHDA共同作用，观察星形胶质细胞HIF-1α蛋白表达的变化以及抑制HIF-1α激活后对星形胶质细胞中DMT1和FPN1的蛋白表达的变化；

使用HIF-2α特异性抑制剂HIF-2α转录抑制剂作用于原代培养的中脑星形胶质细胞后，与6-OHDA共同作用，观察星形胶质细胞中HIF-2α蛋白表达的变化以及抑制HIF-2α激活后对星形胶质细胞中DMT1和FPN1蛋白表达的变化；

基于原代培养的中脑星形胶质细胞和原代培养的中脑腹侧神经元中上述蛋白表达的变化，筛选得到PD预防/治疗中的作用靶点为缺氧诱导因子2α。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，原代培养的星形胶质细胞中HIF-2α的激活能够引起DMT1和FPN1蛋白表达的上调，星形胶质细胞中HIF-2α的抑制亦能够抑制DMT1和FPN1蛋白表达的上调。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，原代培养的星形胶质细胞中HIF-1α抑制剂抑制HIF-1α的蛋白表达，但未抑制6-OHDA引起的原代培养的星形胶质细胞DMT1和FPN1蛋白表达的上调。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用10μM 6-OHDA处理分别以1.5×10⁵/ml的密度接种于预先铺有多聚赖氨酸六孔板中的原代培养的星形胶质细胞和原代培养的中脑腹侧神经元24h后分别提取总蛋白；

结合抑制剂使用说明书及时间筛选实验，利用10μM HIF-1α特异性抑制剂Bay87-2243或HIF-2α特异性抑制剂HIF-2αtranslationinhibitor预处理48h或24h后，加入10μM 6-OHDA共同作用24h后,提取总蛋白。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，总蛋白的提取与定量方法包括以下步骤：

将细胞用6-OHDA或HIF-1α或HIF-2α特异性抑制剂处理后，吸尽培养液，用预冷的PBS洗涤后每孔加入100μl的RIPA细胞裂解液，并冰上裂解0.5h，得到裂解物；

将裂解物收集后于4℃、12000rpm离心20min，将上清液转移到新EP管中；用BCA蛋白定量试剂盒检测提取蛋白浓度，将蛋白按每份30μg分装，于95℃水浴加热5min使蛋白变性，-80℃冰箱冻存。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，星形胶质细胞的培养方式包括：从试验动物中提取分离原代中脑星形胶质细胞，重悬沉淀，筛选后，用胰酶消化、并用星形胶质细胞完全培养液终止消化，然后加入星形胶质细胞完全培养液进行差速粘附处理，调整细胞浓度后接种于预先用多聚赖氨酸处理的六孔板中，稳定24-48h后用于实验；

中脑腹侧神经元细胞的培养方式包括：从试验动物中提取分离原代中脑腹侧神经元细胞，接种于预先用多聚赖氨酸处理的六孔板中，置37℃，5％CO₂培养箱中，5天后用于实验。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，星形胶质细胞完全培养液由DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml、10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素构成。