[发明专利]毕赤酵母生产重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的方法有效
| 申请号： | 201911088025.0 | 申请日： | 2019-11-08 |
| 公开（公告）号： | CN110747198B | 公开（公告）日： | 2021-04-06 |
| 发明（设计）人： | 钱松;李佳佳 | 申请（专利权）人： | 江苏创健医疗科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/12 | 分类号： | C12N15/12;C07K14/78;C12N15/81;C07K1/22 |
| 代理公司： | 常州市权航专利代理有限公司 32280 | 代理人： | 黄晶晶 |
| 地址： | 213000 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 酵母 生产 重组 胶原 蛋白 方法 | ||
1.一种编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链，其特征在于，所述重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链是由权利要求1所述的核苷酸序列编码表达获得。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求1所述的核苷酸序列。
4.一种重组毕赤酵母菌种，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌种的基因组中整合有如权利要求1所述的核苷酸序列，所述重组毕赤酵母菌种基于巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris经过基因工程技术手段构建获得。
5.如权利要求4所述的重组毕赤酵母菌种，其特征在于所述重组毕赤酵母菌种由下述步骤获得：
(1)合成如SEQ ID NO.1所示的编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的核苷酸序列；
(2)设计PCR引物，扩增获取编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的DNA片段 ；
(3)构建重组表达载体；
(4)将制备得到重组表达载体线性化后导入至毕赤酵母中，经筛选获得阳性克隆，得到重组毕赤酵母菌种。
6.一种生产如权利要求2所述的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)培养如权利要求4所述重组毕赤酵母菌种，表达重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链；
(2)分离纯化步骤(1)中所表达的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链：分别使用Strep-tagⅡ标签亲和层析介质、6×His标签的亲和层析介质进行双亲各纯化。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中分离纯化为先采用Strep-tagⅡ标签的亲和层析介质吸附重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链，再用6×His标签的亲和层析介质吸附重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述表达载体构建时的PCR引物如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。
9.如权利要求3所述的表达载体在制备基因工程酵母中的应用。
10.如权利要求4所述重组毕赤酵母菌种在制备重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的应用。
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