[发明专利]毕赤酵母生产重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的方法

说明书

本发明公开了一种毕赤酵母表达制备重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的方法。本发明提供了一种编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由此核苷酸序列SEQ ID NO.1所编码的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。根据本发明所获得的重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链包含成熟的人Ⅱ型胶原α1链的全长氨基酸序列，可有效的支撑Ⅱ型胶原蛋白生物学功能的实现，具有良好的生物学活性，且氨基端、羧基端含有不同的亲和纯化标签，可有效的纯化获取全长单链蛋白，也有利于胶原蛋白的鉴定；同时本发明根据毕赤酵母表达特点，对编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的基因序列进行系统性的计算优化，使其更适于在毕赤酵母中表达。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种编码重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的核苷酸序列及重组人源Ⅱ型胶原蛋白单链的生产方法。

背景技术

在哺乳动物体内，胶原蛋白含量丰富，分布广泛，种类繁多，是细胞、组织乃至器官行使正常功能和机体损伤修复必不可少的重要成份。在胶原家族的众多成员里，Ⅱ型胶原蛋白主要分布在软骨组织、玻璃体、眼角膜中，占成人软骨基质胶原蛋白总量的90％以上。除了具备胶原蛋白基本的生物学功能，如止血性能、生物相容性、生物可降解性、低免疫原性等，Ⅱ型胶原蛋白具备一些独特的生物学功能：(1)可形成网状纤维结构，与蛋白聚糖以及其他成分紧密结合，维持软骨组织的基质成分平衡和完整性，以此赋予软骨良好的弹性、拉伸强度和减震特性等生理特征；(2)促进软骨细胞生长增殖，激活人骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化，延缓软骨细胞去分化现象的出现，有利于软骨细胞再分化状态的维持；(3)诱导免疫耐受，可预防或缓解类风湿性关节炎等病症。Ⅱ型胶原蛋白基因是软骨和骨型形成、骨骼生长和成熟软骨维持等所必需的成份。

软骨组织自愈能力极低，一旦发生损伤或病变，很难依靠自身的分泌能力自我修复，必须进行修复甚至替换。由于Ⅱ型胶原蛋白有极好的生物相容性、可降解性、低免疫原性以及可促进软骨细胞的生长和再分化等能力，Ⅱ型胶原蛋白是软骨的修复和再生医学领域最为理想的材料。

目前，Ⅱ型胶原蛋白的生产主要是利用传统提取法获得，即选取不同种类动物软骨组织，分别经氯仿、盐酸胍、酶解、酸、碱等处理，然后经过透析、离心浓缩、冻干等方法纯化得到Ⅱ型胶原蛋白。这样得到的Ⅱ型胶原蛋白多数为胶原蛋白片断或明胶，序列的完整性无法保证；由于是异源胶原蛋白，临床使用上会出现免疫系统的排异反应；由于原材料来源的庞杂性，还有一些疾病、病毒(如口蹄疫、疯牛病)等生物安全性隐患，这些均限制了其作为生物医学材料方面的应用。

利用基因工程表达重组蛋白是另一种获取Ⅱ型胶原蛋白途径，表达宿主主要为动物细胞、动物体、植物和微生物。动物、植物表达周期长(动物、植物的生长周期往往以月或年计算)、成本高、培养条件复杂、产量低，无法大规模集约化、工业化生产。动物细胞表达主要有昆虫细胞(杆状病毒)表达系统和哺乳动物细胞表达系统两种，ALAKOKKO等使用哺乳动物细胞，NONELAINEN等人、孙京臣等人使用杆状病毒和昆虫细胞均表达出全长的Ⅱ型胶原蛋白。但哺乳动物细胞、昆虫细胞培养难度大、成本高、周期长、产量极低，直至目前只限于实验室规模，无法满足大规模工业化生产的要求。

微生物表达系统相比其他技术有着产量高、生产周期短、培养简单、成本低、易获取高密度发酵等优点，目前应用于胶原蛋白表达的宿主主要有毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母、大肠杆菌等。范代娣等人使用大肠杆菌，重组表达数段人Ⅱ型胶原蛋白的基因片段的拼接重复序列，重组类人Ⅱ型胶原蛋白肽；朱平等人使用大肠杆菌表达了人Ⅱ型胶原蛋白250-270的短小片断。但大肠杆菌表达蛋白质无任何的翻译后修饰，且均不是完整的全长序列，在支撑完成Ⅱ型胶原蛋白的生物学功能会受到极大限制。毕赤酵母发酵表达产率高、培养基简单、表达蛋白稳定且可分泌至胞外易于纯化，蛋白具有翻译后修饰如糖基化等能力，所以使用毕赤酵母异源表达胶原蛋白具有较大优势。