[发明专利]高效表达猪CRTC3的质粒及腺病毒的构建方法及其用途

权利要求书

1.猪CRTC3高效表达载体pAdM-FH-GFP-CRTC3的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

猪CRTC3序列的克隆；

pAdM-FH-GFP腺病毒载体的构建；

插入pAdM-FH-GFP腺病毒载体多克隆位点的猪CRTC3基因。

2.根据权利要求1所述的猪CRTC3高效表达载体的构建方法，其特征在于还包括以下步骤： pAdM-FH-GFP腺病毒包装。

3. 根据权利要求1或2所述的猪CRTC3高效表达载体的构建方法，其特征在于猪CRTC3序列克隆为：根据NCBI上的猪CRTC3预测序列，设计特异性引物Adaptor1、Adaptor2和CRTC3-1、CRTC3-2，采用3'RACE方法得到序列；

Adaptor1：5-cGAAAGCGACAAGGCCGTGATCCCGAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTVN-3

Adaptor2：5-cGAAAGCGACAAGGCCGTGATCCCGAAAGC-3

CRTC3-1：5-GCCACAGGACTCCTTTCATTTG-3

CRTC3-2：5-CACCAGCCTGACAGAAGACTCG-3。

4.根据权利要求3所述的猪CRTC3高效表达载体的构建方法，其特征在于：

设3对特异性引物CRTC3-F1、CRTC3-R1、CRTC3-F2、CRTC3-R2、CRTC3-F3、CRTC3-R3，得到CRTC3基因片段后与3'RACE序列进行拼接，得到猪CRTC3基因全长序列；

CRTC3-F1：ATGGCTGCTTCGCCCGG

CRTC3-R1：GGTGCTTCTCTTCCTTCCAA

CRTC3-F2：TGGAGCTACTTATGCTTCGC

CRTC3-R2：CTGTCTGCTGAAACCTTGATG

CRTC3-F3：TTCCTCTTCCCTCAATAGCCA

CRTC3-R3：AAGTGATTCCAGCATGGGC。

5. 根据权利要求4所述的猪CRTC3高效表达载体的构建方法，其特征是：根据pAdM-FH-GFP载体的信息和猪CRTC3全长基因序列，同时根据pAdM-FH-GFP载体上的AsisI 和MluI酶切位点，构建猪pAdM-FH-GFP-CRTC3表达载体。

6. 如权利要求1~5任一项方法构建所得的猪CRTC3高效表达载体pAdM-FH-GFP-CRTC3的鉴定方法，其特征是：设置对照组pAdM-FH-GFP，通过抗生素筛选，采用Western blot、荧光定量PCR和测序鉴定，荧光定量PCR反应的引物为qCRTC3-F和qCRTC3-R；测序引物为：CMV-F 和BGH引物；

qCRTC3-F ：GACAAGCCAGGACGACAGTT

qCRTC3-R：GGTGCTTCTCTTCCTTCCAA

CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG

BGH：TAGAAGGCACAGTCGAGG。

7.如权利要求1~5任一项方法构建所得的猪CRTC3高效表达载体pAdM-FH-GFP-CRTC3的鉴定方法，其特征是：用于研究示踪猪CRTC3在不同细胞中的定位，构建好的pAdM-FH-GFP-CRTC3转染到293T细胞、猪皮下脂肪细胞后，荧光显微镜下观察到CRTC3亚细胞定位。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征是包括以下步骤：pAdM-FH-GFP-CRTC3转染到猪皮下脂肪细胞的促进脂滴生成的功能及相关调控研究。