[发明专利]高效表达猪CRTC3的质粒及腺病毒的构建方法及其用途

说明书

本发明公开了一种猪CRTC3高效表达载体pAdM‑FH‑GFP‑CRTC3的构建方法，包括以下步骤：猪CRTC3序列的克隆；AdM‑FH‑GFP腺病毒载体的构建；插入pAdM‑FH‑GFP腺病毒载体多克隆位点的猪CRTC3基因；pAdM‑FH‑GFP腺病毒包装。本发明还同时公开了上述猪CRTC3高效表达载体的用途：用于研究示踪猪CRTC3在不同细胞中的定位，构建好的pAdM‑FH‑GFP‑CRTC3转染到293T细胞、猪皮下脂肪细胞后，荧光显微镜下观察到CRTC3亚细胞定位。

技术领域

本发明涉及一种高效表达猪CRTC3(cAMP responsive element bindingregulated transcription coactivators)的pAdM-FH-GFP-CRTC3质粒、腺病毒及其构建方法和用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。

背景技术

能量代谢是一个从外界摄取营养物质到体内细胞分解利用的过程，其中cAMP参与调节细胞能量转换和利用，对机体的生命活动起着重要的作用。研究发现，cAMP-PKA介导的信号通路通过cAMP反应元件结合蛋白CREB及其协同激活子CRTC共同作用调控下游靶基因的转录和翻译。CREB调节转录共激活因子3(CRTC3)是CRTC家族中的一员，在脂肪组织中高度表达，通过调控脂肪组织里的儿茶酚酞信号通路来影响脂肪的代谢和促进肥胖的产生。在白色脂肪细胞中，CRTC3受到盐诱导激酶2(SIK2)的调控，参与了脂肪细胞的葡萄糖摄取调控过程。在棕色脂肪细胞中，CRTC3与C/EBPβ结合调节其转录活性来促进棕色脂肪相关基因解偶联蛋白1(UCP1)等表达。在骨骼肌中，CRTC3的过表达增加了肌内甘油三酯并调节肌球蛋白重链蛋白的合成，促进了脂肪中的脂质沉积。因此，CRTC3是一个重要的糖脂代谢调控基因，维持代谢的稳态。

目前研究集中在鼠CRTC3的基因功能，关于猪CRTC3的基因全长还未见报道，对猪CRTC3的基因功能研究甚少。最近研究也发现，在猪上，CRTC3可能与肌内脂肪沉积密切相关。因此，猪CRTC3基因全长序列克隆及构建高效表达猪CRTC3的质粒、腺病毒研究具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供猪CRTC3基因全长序列和构建猪CRTC3高效表达的质粒、腺病毒的研究方法建立，以及该方法的用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种猪CRTC3高效表达载体(pAdM-FH-GFP-CRTC3，即，带GFP荧光报告基团的CRTC3表达载体)的构建方法，包括以下步骤：

猪CRTC3序列的克隆；

pAdM-FH-GFP腺病毒载体的构建；

插入pAdM-FH-GFP腺病毒载体多克隆位点的猪CRTC3基因。

作为本发明的猪CRTC3高效表达载体的构建方法的改进，还包括以下步骤：pAdM-FH-GFP腺病毒包装。

作为本发明的猪CRTC3高效表达载体的构建方法的进一步改进，猪CRTC3序列克隆为：根据NCBI上的猪CRTC3预测序列，设计特异性引物Adaptor1、Adaptor2和CRTC3-1、CRTC3-2，采用3'RACE方法得到序列(含TGA终止密码子)。

作为本发明的猪CRTC3高效表达载体的构建方法的进一步改进：

设3对特异性引物CRTC3-F1、CRTC3-R1、CRTC3-F2、CRTC3-R2、CRTC3-F3、CRTC3-R3，得到CRTC3基因片段后与3'RACE序列进行拼接，得到猪CRTC3基因全长序列。

作为本发明的猪CRTC3高效表达载体的构建方法的进一步改进：根据pAdM-FH-GFP载体的信息和猪CRTC3全长基因序列，同时根据pAdM-FH-GFP载体上的AsisI和MluI酶切位点，构建猪pAdM-FH-GFP-CRTC3表达载体。