[发明专利]用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对及试剂盒

权利要求书

1.一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对，其特征在于，所述引物对根据中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列进行设计。

2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述的中华绒螯蟹白斑综合征病毒保守区域的核苷酸序列还包括保持SEQ ID NO.3所示的序列的5’端21个碱基、3’端21个碱基不变，序列中有5-7个碱基随机错配得到的序列。

4.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的引物对包括：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5’-CCTACACAGTCCGTCGTGAAG-3’；

反向引物(SEQ ID NO.2)：5’-CGTTCCGTTGACCATAGGGAG-3’。

5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述的引物对还包括在上述引物对3’端碱基不变，序列中1-3个碱基错配得到的引物对。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1-5任一项所述的用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含DNA提取试剂、PCR检测试剂和对照质粒。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的DNA提取试剂为800-1200mmolTris-HCl、200-300mmol EDTA、4500-5500mmol NaCl、8-12％SDS、8-12％NP40和8000-12000μg/ml蛋白酶K。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR检测试剂为10×PCR缓冲液、4dNTPs Mix、200-300pmol/L引物对、20-30mM MgCl₂、3-8U/μL Taq DNA聚合酶；所述的对照质粒含有如SEQ ID NO.3所示的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列。

10.一种权利要求6所述的试剂盒检测中华绒螯蟹白斑综合征的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在组织总DNA提取管中，加0.5-1mL双蒸水溶解，制备组织总DNA提取液，尔后与0.08-0.12g待检组织混合，50-60℃保温0.5-1小时，沸水浴加热4-6分钟，离心8-12分钟，取上清作为DNA模板；

(2)在待检样品PCR管中，加20-30μL双蒸水，溶解后加0.8-1.2μL DNA模板；

(3)在阳性对照PCR管中，加20-30μL双蒸水溶解；

(4)将步聚2、3的PCR管进行PCR扩增；

(5)PCR反应结束后，取8-10μL反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离，根据特异性条带，判别待检样品中有无中华绒螯蟹白斑病毒。