[发明专利]用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对及试剂盒。本发明提供了一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对，本发明的引物对根据如SEQ ID NO.3所示的中华绒螯蟹白斑综合征病毒特异性序列进行设计，实现了中华绒螯蟹白斑病毒的PCR检测。本发明实现了中华绒螯蟹白斑病毒的快速检测，从模板DNA制备、PCR反应、阳性对照体系均有预混液，实现了检测操作过程的标准化、简单化，且可大大减少了操作过程中所引起的污染，减少人为操作所引起的误差。本发明可广泛应于养殖生产中中华绒螯蟹白斑病毒的检测和评估其在养殖生产中的潜在危害。与宏基因组、宏转录组批量检测相比，本发明的技术方案具有速度快、费用低、针对性强，应用性好。

技术领域

本发明涉及一种用于中华绒螯蟹白斑综合征病毒PCR检测的引物对及试剂盒，属于生物检测技术领域。

背景技术

对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)在分类上属线形病毒科(Nimaviridae)、白斑病毒属(Whispovirus)，是一种大型的杆状双链DNA 病毒，具有双层囊膜，不能形成包涵体。囊膜大小为210-420nm×70-167nm，病毒核衣壳大小为180-420nm×54-85nm。

WSSV是一种复制迅速和极其致命的对虾病原体，它于1992首次在中国台湾被发现，然后传播到日本和几乎所有亚洲国家。目前在全球范围内WSSV是危害对虾养殖业最严重的病原。WSSV除了能感染大多数对虾品种之外，还能感染其它非对虾种类，如端足类、介形类、蟹类、龙虾类、桡足类、水蝇类等甲壳纲动物，迄今为止，已报道有90种以上的节肢动物是WSSV的宿主或携带者。其外，也发现蠕虫、轮虫也是WSSV的携带者或中间宿主。已有一些报道指出海鸟也是WSSV传播的潜在来源。

蟹是一种广泛养殖的水产品种，已在蓝蟹(Callinectes sapidus)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、淡水蟹(Paratelphusa hydrodomus、P.pulvinata)、印度海蟹(Indian marine crabs)、远海梭子蟹(Portunus pelagicus)，mud crab巨缘青蟹(Scyllaserrata)等38种蟹中通过PCR检测到WSSV。中华绒螯蟹是我国养殖量最大的蟹种，2015年有学者首次报道池塘养殖的中华绒螯蟹感染WSSV，造成很高的死亡率。WSSV有多种分离株，其毒力有所差异。肌肉注射 WSSV-TW型和WSSV-CN-Pc克氏原螯虾(Procambarus clarkii)均在第6天出现100％的死亡；但罗氏沼虾在肌肉注射WSSV-TW后未出现死亡，但在注射 WSSV-CN-Pc后的第9天死亡率达100％。经口注射WSSV-CN-Pc和WSSV-TW 的克氏原螯虾均在第16天出现100％的死亡；罗氏沼虾经口注射WSSV-CN-Pc 后的第19天死亡率为100％，但注射WSSV-TW的实验组并未出现死亡。说明不同的WSSV分离株的毒力不同，同一个分离株对不同宿主的毒力也不同。 WSSV是白斑病毒属(Whispovirus)的一个种，WSSV可以感染中华绒螯蟹，但中华绒螯蟹是否存在自己的白斑病毒目前还无明确的报道。

通过组织病理学观察和电子显微镜观察，可以判断宿主是否感染白斑病毒，但在分类上难以判断是哪一种病毒。分子生物学的方法为白斑病毒的种类鉴定和检测提供了强有力的手段。利用一对WSSV特异性引物，结合一条特异性探针，用荧光PCR技术对WSSV DNA进行体外扩增检测，用于对可疑感染者的病原学诊断。现有的文献中提供了多种WSSV的检测方法，但是现有的这些检测均只涉及到对虾WSSV，并没有涉及到感染中华绒螯蟹的白斑病毒属的其它成员。有关中华绒螯蟹病毒性疾病的研究非常有限，养殖生产上经常发生一些不明病因或病原的疾病，例近年来常发的中华绒螯蟹肝胰腺坏死征。因此，分离鉴定、检测中华绒螯蟹组织中的相关病毒，掌握其宿主域及危害，对中华绒螯蟹的疾病防治有重要意义，对防止或限制其传播有重要帮助，也能够帮助评价其对野生群体的潜在危害。

发明内容