[发明专利]一种嵌合抗原受体T细胞及其应用

说明书

本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞及其应用，所述嵌合抗原受体T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、IL‑7和CCL19；所述IL‑7的信号肽为T细胞分泌蛋白的信号肽；所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。本发明通过对IL‑7和CCL19进行优化，改变IL‑7的信号肽并将CCL19的持续性分泌改变为条件性分泌，构建的CAR‑T细胞能够将IL‑7持续性分泌到胞外，在识别肿瘤抗原后表达分泌CCL19、最大程度将免疫细胞招募到肿瘤内部，显著提高了CAR‑T细胞的抗肿瘤效果。

技术领域

本发明属于肿瘤的细胞免疫治疗领域，涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其应用，尤其涉及一种高水平稳定表达细胞因子和去化因子的嵌合抗原受体T细胞及其在制备抗肿瘤治疗药物中的应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)免疫治疗是通过在T细胞膜上表达特异性识别并结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体分子，诱导T细胞活化，从而实现对肿瘤细胞特异性杀伤的一种技术。

目前，CAR-T免疫治疗方法在白血病治疗领域取得了巨大突破，美国FDA已经批准了两种靶向CD19的CAR-T细胞产品上市，国内也有多家公司针对CD19的靶点开展了临床试验。

虽然CAR-T技术在血液瘤的治疗方面取得了一定突破，但是在实体瘤的治疗上仍然没有比较好的效果。近年来，科研人员对CAR-T疗法进行了深入研究和优化，例如：通过提高嵌合抗原受体的亲和力，使CAR-T细胞能够高效识别并结合肿瘤细胞，提高杀伤效果；研发识别两种抗原的CAR-T细胞，提高CAR-T细胞对表达多抗原的肿瘤细胞的杀伤能力；通过基因编辑技术敲除CAR-T细胞的PD-1，使CAR-T细胞在肿瘤微环境中不被抑制活性，促进CAR-T细胞发挥有效的杀伤能力。

Adachi等近期报道了新的研究成果(CN107109421A、CN109153989A)，将编码IL-7和CCL19的核酸序列由编码自切割肽的序列连接，构建的CAR-T细胞持续分泌IL-7和CCL19，一方面IL-7可以提高CAR-T细胞的体外扩增能力，另一方面当CAR-T细胞回输到小鼠体内后，浸润到肿瘤内的CAR-T细胞通过分泌的CCL19招募到更多的外周血循环T细胞和树突状细胞到肿瘤内，同时IL-7可以提高免疫细胞的存活能力，从而增强CAR-T细胞的抗肿瘤效果；但是，当CAR-T细胞留存在脾脏、淋巴结等免疫细胞较多的地方时，CCL19会将外周血循环T细胞和树突状细胞招募到特定部位，减少血液循环中的T细胞和树突状细胞的比例，从而降低了T细胞和树突状细胞被招募到肿瘤内的几率，因此这种使CAR-T细胞持续分泌CCL19的方法虽然可以招募更多的免疫细胞到肿瘤内发挥作用，但是同时也会将免疫细胞招募到其他部位，不能实现将外周血免疫细胞最大程度招募到肿瘤内部的效果。

此外，T细胞在自然情况下不分泌IL-7，因此T细胞对IL-7的表达调控在转录水平、蛋白质翻译水平和蛋白质分泌到胞外三个层面都是禁止的。虽然外源导入IL-7可以使T细胞转录和翻译IL-7蛋白，但是IL-7蛋白分泌到胞外仍然受到T细胞的严格控制，Adachi等报道的研究存在外源IL-7蛋白无法分泌到T细胞外的问题。

CN109504660A公开了一种第四代CAR-T细胞及其构建方法和应用，所述CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区、细胞因子信号区，其中，胞膜外抗原结合区以Nectin-4抗原的两个空间表位为靶点，细胞因子信号区为IL7和CCL19，但是同样存在外源IL-7蛋白无法分泌到T细胞外、CCL19的持续性分泌无法最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部的问题。

因此，构建一种新型CAR-T细胞，不仅能分泌IL-7和CCL19，而且能将外源IL-7蛋白分泌到T细胞外，同时CCL19最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，在肿瘤的治疗领域具有重要意义。

发明内容