[发明专利]一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法

说明书

本发明公开了一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法,步骤：(1)将糖基转移酶UGT1和糖基转移酶UGT2交联在活化后的壳聚糖小球上，获得固定化糖基转移酶；(2)向容器中加入莱鲍迪苷A，加入尿苷二磷酸葡萄糖，加入所述固定化糖基转移酶催化，得到莱鲍迪苷M；本发明固定化糖基转移酶易分离、可反复利用、热稳定性高、操作稳定性高，与游离酶相比，本发明的固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A直接生成莱鲍迪苷M收率较高；游离酶只能使用1次，而固定化糖基转移酶可重复使用，重复使用10次后，仍然保持第一次使用的50％以上的活性。本发明方法简单，易于实现。减少工艺流程，降低成本，提高生产效率。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地涉及一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法。

背景技术

甜菊糖苷是一种从菊科草本植物甜菊叶中精提的新型天然低热量甜味剂甜菊糖苷类化合物,因其甜度高、热量低、无毒性、耐高温、耐酸碱和水溶性好等优点，被美国食品药品监督管理局认证为安全，可应用于食品行业。莱鲍迪苷M,是一种新发现的糖苷,与其它糖苷相比,其甜度高,约为蔗糖的400倍,且甜味纯正,口感也更接近蔗糖,甘苦味和甘草异味低,稳定性好,是一种理想的天然甜味剂产品。2013年,美国FDA批准使用从甜叶菊叶子中提取的含有50％含量莱鲍迪苷M的甜菊糖产品,并承认它的一般安全性(GRAS)。2014年,美国通过从甜叶菊叶子中提取的含有95％含量的GRAS认可,批准在除婴幼儿食品以外的饮料和食品中使用。2015年,澳大利亚新西兰食品标准局批准莱鲍迪苷M作为甜味剂用于食品。

甜叶菊叶子中莱鲍迪苷M的含量极少,且只在甜菊Morita植株中检测的到。采用植物叶提取法生产需要大量的甜叶菊原料,另外富集的工艺繁琐,提取后需要多次过柱和脱盐、脱色、重结晶,并在生产过程中产生大量的废水,其生产成本较高,不适合工业化大生产。以莱鲍迪苷D为底物，通过微生物产酶催化法可获得莱鲍迪苷M，该方法较传统的提取法，不仅改善了生产流程，并且降低了对环境的污染，提高了目的产物莱鲍迪苷M的产率。但目前以生物酶催化法主要存在以下几个问题：(1)以生物酶催化莱鲍迪苷D生产莱鲍迪苷M的成本较高，并且酶产率有待进一步优化；(2)用于催化的糖基转移酶不易与产物分离并回收利用，且易失活；(3)天然植物中莱鲍迪苷A含量很高，而莱鲍迪苷M含量非常低，以低成本由莱鲍迪苷A直接转化为莱鲍迪苷D也是亟待解决的难题。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种固定化糖基转移酶催化莱鲍迪苷A生成莱鲍迪苷M的方法，包括如下步骤：

(1)将糖基转移酶UGT1和糖基转移酶UGT2交联在活化后的壳聚糖小球上，获得固定化糖基转移酶；

(2)向容器中加入莱鲍迪苷A，加入尿苷二磷酸葡萄糖，加入所述固定化糖基转移酶催化，得到莱鲍迪苷M；

所述糖基转移酶UGT1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述糖基转移酶UGT2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤(1)优选为：按1g:10-20mL的比例，将活化后的壳聚糖小球与浓度为0.025-0.1mg/mL的糖基转移酶UGT1水溶液混匀，在15-20℃条件下交联8-20h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶UGT1；按1g:10-20mL的比例，将活化后的壳聚糖小球与浓度为0.025-0.1mg/mL的糖基转移酶UGT2水溶液混匀，在15-20℃条件下交联8-20h，过滤，固体用去离子水清洗干净后，得到固定化糖基转移酶UGT2；将所述固定化糖基转移酶UGT1和固定化糖基转移酶UGT2混合，获得固定化糖基转移酶。