[发明专利]一种检测细菌数量的方法

权利要求书

1.一种检测细菌数量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：称取适量样品，对样品进行溶解稀释处理，再离心处理后弃除上清液；

步骤2：对步骤1处理后的样品液进行固定处理，再离心处理后弃除上清液；

步骤3：对步骤2处理后的样品液进行漂洗处理，再离心处理后弃除上清液；

步骤4：对步骤3处理后的样品液进行脱水处理，再离心处理后弃除上清液；

步骤5：对步骤4处理后的样品液进行超声分散处理，取适量的样品进行喷金处理，得到待观察的样品；

步骤6：将待观察的样品放入场发射扫描电子显微镜的样品室内，进行成像计数，得到单位样品中细菌的数量。

2.如权利要求1所述的一种检测细菌数量的方法，其特征在于，所述步骤1中，采用磷酸盐缓冲液对样品进行溶解稀释处理。

3.如权利要求2所述的一种检测细菌数量的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。

4.如权利要求3所述的一种检测细菌数量的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：在1.36g磷酸二氢钾中加入0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，即得pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

5.如权利要求1所述的一种检测细菌数量的方法，其特征在于，所述步骤2中，采用2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液对样品进行固定处理，具体的固定处理步骤为：

2.1、将2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液注入样品中，充分均匀，密封，冷藏时间为1～2小时，冷藏温度为0～5°C；

2.2、对冷藏后的样品进行超声分散处理，再继续进行冷藏，冷藏时间为1～2小时，冷藏温度为0～5°C。

6.如权利要求5所述的一种检测细菌数量的方法，其特征在于，所述2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液是由25%戊二醛、无菌水、磷酸盐缓冲液按体积比为1:4:5配制而成的。

7.如权利要求1所述的一种检测细菌数量的方法，其特征在于，所述步骤4中，依次采用质量百分比浓度为30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇进行梯度离心脱水，每个梯度的离心脱水时间为8～15min。

8.如权利要求1所述的一种检测细菌数量的方法，其特征在于，所述步骤5的具体操作过程为：在步骤4处理后的样品液中加入质量百分比浓度为100%的乙醇，进行超声分散5～10min，再取适量样品置于粘有导电胶的扫描电子显微镜的样品台上，进行抽真空干燥处理，然后再进行喷金处理。

9.如权利要求1所述的一种检测细菌数量的方法，其特征在于，所述步骤6中，单位样品中细菌的数量的计算公式为：

其中，U为单位样品中细菌的数量，单位为CFU/g，X为扫描电子显微镜中细菌的计数总量，单位为CFU，a为样品的稀释倍数，单位为ml，m为步骤1的取样量，单位为g，l为步骤5中的取样量，单位为ml。