[发明专利]一种检测细菌数量的方法

说明书

本发明公开了一种检测细菌数量的方法，涉及微生物检测技术领域。所述检测细菌数量的方法，在观察计数前先对样品进行一系列的处理，再采用扫描电子显微镜进行成像计数，在一系列的处理中，固定处理避免了计数过程中细菌运动导致计数不准确的问题，同时固定处理还可以避免由于气压和电子束轰击等导致细菌结构易变形的问题；利用扫描电子显微镜成像计数，可以直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像，对细菌浓度没有要求，且可以放大几十到上百万倍，基本上对细菌大小没有限制，同时扫描电子显微镜自带测量尺寸的功能，可以快捷地测量细菌的尺寸，且识别率高，能够区分微生物与微小杂物，在计数时将微小杂物排除，提高了计数的准确度。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种利用场发射扫描电子显微镜成像检测细菌数量的方法。

背景技术

目前，微生物计数方法分为直接计数法、间接计数法，微生物显微镜直接计数法是将微生物均匀菌液滴至干净的血球计数板上，然后置于显微镜下，将微生物放大至合适的倍数，肉眼观察，进行计数的方法。

微生物显微镜直接计数法具有以下缺点：①不适用于对运动细菌的计数；②需要相对高的细菌浓度；③个体小的细菌在显微镜下难以观察，仅适用于菌体偏大的菌体或孢子；④菌体大小测定过程麻烦；⑤微小杂物亦可能被计算在内，使结果偏高；⑥不能区别活菌与死菌，使活菌计数的结果偏高；这些缺点使微生物显微镜直接计数法具有一定的局限性。

发明内容

针对现有技术中微生物显微镜直接计数法存在的缺陷，本发明提供一种检测细菌数量的方法，以解决背景技术中微生物显微镜直接计数法所存在的缺陷。

本发明是通过如下的技术方案来解决上述技术问题的：一种检测细菌数量的方法，包括以下步骤：

步骤1：称取适量样品，对样品进行溶解稀释处理，再离心处理后弃除上清液；

步骤2：对步骤1处理后的样品液进行固定处理，再离心处理后弃除上清液；

步骤3：对步骤2处理后的样品液进行漂洗处理，再离心处理后弃除上清液；

步骤4：对步骤3处理后的样品液进行脱水处理，再离心处理后弃除上清液；

步骤5：对步骤4处理后的样品液进行超声分散处理，取适量的样品进行喷金处理，得到待观察的样品；

步骤6：将待观察的样品放入场发射扫描电子显微镜的样品室内，进行成像计数，得到单位样品中细菌的数量。

本发明所述的方法，在成像计数前先对样品进行一系列的处理，再采用扫描电子显微镜进行成像计数，在一系列的处理中，固定处理避免了计数过程中细菌运动导致计数不准确的问题，同时固定处理还可以避免由于气压和电子束轰击等导致细菌结构易变形的问题；利用扫描电子显微镜成像计数，可以直接利用样品表面材料的物质性能进行微观成像，对细菌浓度没有要求，且可以放大几十到上百万倍，基本上对细菌大小没有限制，同时扫描电子显微镜自带测量尺寸的功能，可以快捷地测量细菌的尺寸，且识别率高，能够区分微生物与微小杂物，在计数时将微小杂物排除，提高了计数的准确度；在步骤1至4中，均进行离心处理后弃除上清液以提高细菌的浓度，使在观察时细菌充盈样品室，提高了细菌数量的检测精度。

进一步地，所述步骤1中，采用磷酸盐缓冲液对样品进行溶解稀释处理，调节细菌的pH值，使细菌保持恒定的pH值，以便在细菌最佳状态下进行观察。

进一步地，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.4。

进一步地，所述磷酸盐缓冲液的配制方法为：在1.36g磷酸二氢钾中加入0.1mol/L氢氧化钠溶液79ml，用水稀释至200ml，即得pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

进一步地，所述步骤2中，采用2.5%磷酸缓冲戊二醛固定液对样品进行固定处理，具体的固定处理步骤为：