[发明专利]一种同时检测青霉和镰刀菌的微滴数字PCR检测方法

说明书

本发明涉及一种用于同时检测青霉和镰刀菌的引物、探针。本发明还涉及用于测定食品中青霉和镰刀菌的双重微滴数字PCR检测方法，所述方法包括使用针对青霉和镰刀菌检测的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于食品中青霉和镰刀菌的双重微滴数字PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性寡核苷酸引物及探针。使用本发明的双重微滴数字PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地同时检测青霉和镰刀菌。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于高特异、高灵敏度的快速检测青霉和镰刀菌的寡核苷酸引物和探针以及包含所述引物对和探针的双重微滴数字PCR检测试剂盒，用于测定青霉和镰刀菌的双重微滴数字PCR检测方法，以及所述引物对和探针或试剂盒在快速检测青霉和镰刀菌中的应用。

背景技术

青霉，一般是指青霉属（Penicillium），和曲霉属（AsPergillus）有亲缘关系，有二百几十种，代表种是灰绿青霉，从土壤或空气中很易分离。分枝成帚状的分生孢子从菌丝体伸向空中，各顶端的小梗产生链状的青绿—褐色的分生孢子，根据分生孢子顶端的膨大与否，与曲霉属（AsPergillus）相区别。自从弗莱明（A．Fleming，1929）发现特异青霉（Penicillium notatum）产生抑制细菌生长物质青霉素以来，已对该属菌的很多种进行了研究。特异青霉已被用于制造青霉素，但不具这种机能的种还很多，同时很多青霉甚至产生毒枝菌素。

镰刀菌为一种重要的植物病原真菌，在自然界中营寄生或腐生生活。到目前为止已鉴定的镰刀菌有 40 多种，其中以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、串珠镰刀菌（Fusarium verticillioides）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）分布最为广泛且危害严重。赤霉病主要分布于气候温暖、湿润的温带地区，受生态环境、寄主范围以及生物因素等影响，镰刀菌的分布呈现地域性特征。

产毒真菌的分类鉴别一般采用形态学方法，主要按照真菌的形态、生理特点、抗原构造等特征加以区分。但是，常规的形态学检测方法存在一定的缺陷，如菌的种类较多、形态特征复杂、部分形态特征和生理生化指标随环境的变化而不稳定、种的水平上鉴别不准确、耗时长等，国内外研究者业已研发出系列以免疫亲和柱等前处理产品结合色谱-质谱联用的多元化毒素精准检测体系，有效地改善了食品及饲料中真菌毒素的检测能力。尽管如此，现有仪器法仅靶向于毒素本身，无法在毒素形成前或早期预测样品产毒潜能，有效前置化干预毒素危害。总体而言，若毒素已能从食品或饲料中检测出，其污染已十分严重，受感染的产品仅能毁灭处置，无法挽回经济损失及对受污染产品摄入者的危害。因此，提前监测产毒真菌的存在与否对避免潜在毒素危害意义卓著。

本发明基于以数字PCR为基础的分子生物学技术，以青霉和镰刀菌的核酸为检测基础，青霉的β-微管蛋白编码区、镰刀菌LS rRNA序列为靶基因设计引物及探针，利用数字PCR法检测青霉和镰刀菌。建立的双重微滴数字PCR检测方法，能同时检测两种真菌，突破现有仪器法仅靶向于毒素本身，无法在毒素形成前或早期预测样品产毒潜能，提前监测青霉和镰刀菌的存在与否，实现有效防控毒素污染和危害，为青霉和镰刀菌的诊断添加快速、精准的技术手段。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供快速检测青霉和镰刀菌的特异性寡核苷酸引物及探针。

本发明的另一个目的在于，提供快速测定青霉和镰刀菌的微滴数字PCR检测方法。

本发明提供青霉和镰刀菌的特异性寡核苷酸引物和探针在检测食品中青霉和镰刀菌的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：