[发明专利]一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体及其应用

说明书

一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体及其应用，该突变体是将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶进行如下任一突变后获得的：(1)将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基进行F296L突变；(2)将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基进行Y351A突变；(3)将鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基进行S392A突变；(4)在鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的ɑ亚基的E388与D389位之间插入一段长度由GHFCGLLQLSKRFEQ组成的15个氨基酸多肽片段。本发明的鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体可利用空气中氧气作为电子受体，具有更好的底物亲和力和催化效率，可降低生产成本，更加适用于工业化生产应用。

技术领域

本发明涉及一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶及其应用，在鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶的基础上，通过点突变制造黄嘌呤氧化酶活性增强的黄嘌呤脱氢酶突变体，及其在降解含次黄嘌呤和黄嘌呤材料中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

黄嘌呤氧化还原酶(Xanthine oxidoreductase，简称XOR)是一种包含铁硫簇、钼蝶呤和黄素辅基的氧化还原酶，它具有黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，简称XOD，EC1.17.3.2)和黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase，简称XDH,EC 1.17.1.4)两种不同的存在形式。它可以利用O₂、NAD⁺和亚甲基蓝等作为电子受体，氧化催化包括嘌呤、蝶呤、杂环分子等在内的多种底物的氧化反应(李丽书,陈献华,邵叶波,等.黄嘌呤氧化还原酶的结构、功能和作用[J].细胞生物学杂志,2004,26(4):381-384.)。X0R具有重要的商业应用价值，其中黄嘌呤氧化酶的应用主要涉及五个方面，分别是药物代谢、核苷类药物合成、体外检测、生物修复、健康食品方面(王成华,邢新会.黄嘌呤氧化酶的研究进展及其发展前景[J].广西科学,2017,24(1):15-24.)。临床上可用于制备免疫抗体、肿瘤抑制剂和细胞缺血性再灌注损伤等疾病的检测(李忠琴.节杆菌黄嘌呤氧化酶的发酵、纯化、特性及基因研究[D].江苏:江南大学,2007.)。

XOD是由前体蛋白XDH经过巯基氧化可逆转变或者通过酶解断裂不可逆转变而来，利用分子O₂作为电子受体，但失去了XDH所具有的利用NAD⁺作为电子受体的能力。它们是同一基因转录表达的产物，其中XDH是基因转录后的直接产物，是在体内的主要存在状态(Woolfolk,C.A.and J.s.Downard,Distribution of xanthine oxidase and xanthinedehydrogenase specificity types among bacteria.J Bacteriol,1977.130(3):1175-91)。相对于XDH利用昂贵的NAD⁺作为电子受体而言，可以直接利用空气中0₂作为电子受体的XOD成为商业用酶的首选。

目前，商品化X0D仅限于提取法生产。例如从牛奶奶油等动物源材料中提取的牛奶XOD，从野生藤黄节杆菌等野生微生物中提取的细菌XOD。牛奶黄嘌呤氧化酶是目前市场上最主要的XOD，也是最早获得专利并投向市场的酶。然而，XDH到X0D的复杂转变过程，存在着活性X0D与前体蛋白混杂与活性XOD含量低的问题，不仅影响到XOD的活性和得率，还增加了酶的使用成本，造成XOD价格高昂，限制了其应用发展(Enroth,C.,et al.,Crystalstructures of bovine milk xanthine dehydrogenase and xanthine oxidase:structure-based mechanism of conversion.Proc Natl Acad Sci USA，2000.97(20):10723-8)。