[发明专利]来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法

权利要求书

1.一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

组织分离：取胎盘组织样本，以组织清洗液清洗，分离出绒毛膜组织，再次以组织清洗液洗至绒毛膜组织呈半透明态；

组织冻存：将上述绒毛膜组织置于冻存液中，按照预定程序降温后冻存；

组织处理：取出冻存的绒毛膜组织，以酒精溶液浸泡，随后用组织清洗液清洗，洗去残留的酒精和血液，去除绒毛膜板上附着的胎盘小叶组织、绒毛干、血管和血管内的血凝块，得剔除杂质后组织，剪碎，得组织块；

细胞培养：将上述组织块置于培养瓶中，加入间充质干细胞选择培养基，置于CO₂培养箱中培养，待细胞融合度达到80±10％时对细胞进行传代，传代细胞继续扩大培养和/或冻存。

2.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述组织清洗液包括：生理盐水、25±5μg/ml的硫酸庆大霉素和5±1μg/ml的两性霉素B。

3.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述冻存液包括：右旋糖酐系蔗糖、非必需氨基酸、海藻糖、二甲基亚砜、人血白蛋白、无血清培养基。

4.根据权利要求3所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述冻存液中，右旋糖酐系蔗糖浓度为5±0.5％，非必需氨基酸浓度为2±0.2％、海藻糖浓度为0.2±0.02mol/L、二甲基亚砜浓度为10±1％、人血白蛋白浓度为5±0.5％。

5.根据权利要求8所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述组织冻存步骤中，按照以下程序降温，温度降低过程如下：4℃保持40min，-20℃保持50min，-40℃保持30min，-80℃保持12h，然后将绒毛膜组织置于液氮罐中，进行深低温保存。

6.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述组织处理过程中，以75％的酒精浸泡1±0.5min。

7.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述组织处理过程中，将组织剪碎为最大面积为1-2mm²的组织块。

8.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞选择培养基包括：间充质干细胞无血清培养基，5±0.5％的人血白蛋白，15±5ng/ml的bFGF，10±1％的转化生长因子。

9.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述组织分离步骤之前，还包括组织采集步骤，所述组织采集步骤中，采集胎盘组织，检测微生物及病毒，合格胎盘在组织保护液存在条件下0-4℃保存和/或运输。

10.根据权利要求1所述的来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，其特征在于，所述细胞培养步骤中，检测传代培养得到的胎盘绒毛膜间充质干细胞表型，但CD73、CD90、CD105阳性率均≥95％，CD34、CD45阳性率均≤5％，停止传代，收获细胞，即得。