[发明专利]来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法

说明书

本发明涉及一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，属于细胞生物学技术领域。该方法包括以下步骤：组织分离：取胎盘组织样本，分离出绒毛膜组织，以组织清洗液洗至绒毛膜组织呈半透明态；组织冻存：将上述绒毛膜组织置于冻存液中，按照预定程序降温后冻存；组织处理：取出冻存的绒毛膜组织，以酒精溶液浸泡，剔除杂质后，剪碎，得组织块；细胞培养：将上述组织块置于培养瓶中，加入间充质干细胞选择培养基，置于CO₂培养箱中培养，待细胞融合度达到80±10％时对细胞进行传代，传代细胞继续扩大培养和/或冻存。该方法使胎盘绒毛膜板组织及分离制备得到的间充质干细胞都可以在液氮环境中长期储存，再次复苏之后仍保持细胞活性。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC)是一类来源于中胚层的具有高度自我更新和多向分化能力的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可以在体外条件下进行培养扩增。在特定的条件下，分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。MSC作为多能干细胞的代表，具有“横向分化”或“跨系分化”的能力，可以在不同的诱导条件下，分化成为多种组织细胞。MSC具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞，是移植领域和自身性免疫疾病治疗的研究热点。

间充质干细胞最早来源于骨髓，但骨髓中的间充质干细胞含量较少，无法满足目前疾病治疗及研究的需求。在科学逐步的探索中，也发现了很多其他来源的间充质干细胞，例如脐带、脐血、胎盘、牙髓、骨髓、脂肪、肌肉、牙周质等。其中胎盘来源间充质干细胞与其他多种间充质干细胞相比，MSC的含量充足，来源于新生儿的附属组织，免疫原性较低且无社会伦理争议。这多种优点使得胎盘来源的MSC具有更好的临床应用前景。

胎盘是母体与胎儿间进行物质交换的器官，是胚胎与母体组织的结合体，在胎儿的发育、营养摄取和免疫耐受方面起着关键作用。足月胎盘是一个较大的组织(500-750g)，可在胎儿分娩后无菌采集，对供者无风险，易于获得。与骨髓间充质干细胞相比，胎盘间充质干细胞来源广泛、采集方便、免疫原性低、无侵入性操作以及无伦理争议等，具有广阔的临床应用前景。胎盘组织结构复杂，包括胎儿侧的羊膜、绒毛膜以及母体侧的蜕膜等。因此，胎盘来源的间充质干细胞又有很多种，包括羊膜MSC、绒毛膜MSC、蜕膜MSC等。

其中，人胎盘绒毛膜间充质干细胞是典型的成纤维细胞形态。细胞表达表面标记CD13、CD26、CD29、CD54、CD73、CD90、CD105和CD166，不表达CD1α、CD3、CD14、CD31、CD34、CD45。在不同的条件培养基及诱导剂存在的状态下，细胞可以向成骨、成脂及成软骨方向进行分化。另外，对比其他多种间充质干细胞，胎盘绒毛膜MSCs的HGF和VCAM-1分泌量最高，而VCAM-1即为血管细胞黏附分子1，在发挥免疫调节和促进血管新生的功能中具有非常重要的作用。胎盘绒毛膜MSCs的这一显著功能引起众多研究学者的关注并开始开展基础及临床研究，是未来临床疾病治疗更为理想的种子细胞。

然而，胎盘绒毛膜组织位于脐带和胎盘连接处，属于较薄且透明的组织，在进行组织分离的过程中，容易夹杂有上皮组织的成分，进而在细胞培养过程中混有大量的上皮细胞，影响绒毛膜MSCs的纯度。对细胞后期的使用造成不便甚至影响细胞的使用效果。另外，关于胎盘绒毛膜MSCs的分离、制备及冻存方法目前没有固定，很难保证不同批次的细胞的分离效率、细胞存活率及细胞复苏之后的活性等。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，该方法主要是应用于胎盘与脐带连接处的胎盘绒毛膜板组织的分离、冻存及间充质干细胞的制备，使胎盘绒毛膜板组织及分离制备得到的间充质干细胞都可以在液氮环境中长期储存，再次复苏之后仍保持细胞活性。

一种来源于胎盘绒毛膜板组织的间充质干细胞制备方法，包括以下步骤：