[发明专利]一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法

说明书

本发明公开了一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法，该核苷酸序列为如SED ID NO.5所示，本发明通过原核表达体系表达藜麦抑制白色念珠菌蛋白，表达方法包含：(1)将全基因合成的菌种进行扩大培养，提取质粒，以该质粒为模板，采用PCR扩增引物，进行PCR扩增；(2)将目的片段回收，与PET‑30a+载体进行连接，之后进行测序分析；(3)将目的片段与表达载体连接之后转化大肠杆菌；(4)对目标菌种进行扩大培养，加入IPTG诱导蛋白表达，得到表达蛋白完成的菌液。该方法为藜麦抗白色念珠菌蛋白的大规模生产提供一种更为良好的实际应用途径。

技术领域

本发明涉及一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列，具体涉及一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法。

背景技术

白色念珠菌(Candida albicans)为泌尿系统感染的主要元凶，目前主要的治疗手段是达克宁栓和克霉挫栓剂，但是往往治疗效果不好，引起反复。更严重者需要口服伊曲康唑或者氟康唑等抗真菌药物。然而，口服对肝脏有严重损伤并且真菌容易产生耐药性，这也是临床上病情反复的原因之一。

抑制白色念珠菌蛋白是一类病程相关蛋白，主要来源于作物。目前有研究表明，在富含淀粉的籽粒中通常含有对白色念珠菌具有强烈的抑制作用的蛋白。而这一类型蛋白对白色念珠菌的作用属于物理渗透性，即在适合的条件下依靠物理作用造成白色念珠菌内容物泄露而死亡，因此不会产生耐药性。

该蛋白对白色念珠菌的作用仅在玉米上有过报道，而在藜麦中尚未有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白的核苷酸序列及引物和方法，通过构建表达藜麦抑制白色念珠菌蛋白的原核表达体系，为藜麦抑制白色念珠菌蛋白的大规模生产提供一种更为良好的实际应用途径。

为了达到上述目的，本发明提供了一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的PCR扩增引物，该PCR扩增引物，其上游引物为如SED ID NO.1所示的核苷酸序列，其下游引物为SEDID NO.2所示的核苷酸序列；或其上游引物为如SED ID NO.3所示的核苷酸序列，其下游引物为SED ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列，该核苷酸序列为如SED ID NO.5所示。

本发明还提供了一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因编码的氨基酸序列，该氨基酸序列为如SED ID NO.7所示。

本发明还提供了一种藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因载体的构建方法，该方法包含：

(1)将核苷酸序列为如SED ID NO.5所示的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因和载体进行连接反应；

(2)将步骤(1)得到的连接产物转化到CaCl₂感受态细胞中，在转化后CaCl₂感受态细胞中加入预热的LB液体培养基，混匀，于恒温摇床上震荡培养；

(3)将步骤(2)得到的重组菌种涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的IPTG/X-gal平板上，于恒温过夜培养，若蓝斑不明显将平板于4℃冻存；

(4)在ITPG/X-gal平板上挑选白色单菌落，将其置于含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在温度为37℃条件下振荡培养，获得含有藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的载体菌种。

本发明还提供了一种含有所述的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因的核苷酸序列的克隆载体。

优选地，该克隆载体为pET-30a+。

本发明还提供了一种原核生物中表达的藜麦抑制白色念珠菌蛋白基因核苷酸序列，该核苷酸序列为如SED ID NO.6所示。