[发明专利]一种基于高通量测序的mRNA检测方法

权利要求书

1.一种基于高通量测序的mRNA检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，包括如下步骤：

1）提取样本总RNA并质控：所述样本为RNA降解较为严重的福尔马林固定石蜡包埋FFPE的样本；并且需要对RNA进行质控，得到DV200质控值；RNA总量不低于10ng，浓度不低于2ng/ul，RNA的 260/280吸光值在1.8-2.0之间，RIN值不低于1，DV200不低于20%；

2）根据总RNA质控情况进行总RNA打断和引物杂交：其中，DV200大于等于30%的RNA样本，需要先打断，再进行引物杂交，对于DV200小于30%的RNA样本，不需要打断，直接进行引物杂交；所述的引物为随机引物，其长度范围为 5-10 bp；

3）合成第一链cDNA：在逆转录酶的作用下，以总RNA为模板，合成cDNA第一链；

4）合成第二链cDNA：在DNA聚合酶的作用下，以第一链cDNA为模板，合成含有dUTP的cDNA第二链；

5）构建链特异性cDNA文库：取纯化后的cDNA产物，加入末端修复缓冲液和末端修复酶混合物进行末端修复反应；反应完成后加入接头、连接缓冲液、增强子及无核酶水进行连接反应；反应完成后加入尿嘧啶特异性切除酶切除含有U碱基的cDNA第二链；产物纯化后，加入标签引物进行文库扩增反应，经纯化后得到链特异性的cDNA文库，对文库进行定量和质控，文库总量不低于200 ng；

6）第一次杂交和捕获；取链特异性的cDNA文库，加入杂交缓冲液和全外显子探针进行第一次杂交和捕获；

7）第二次杂交和捕获；在第一次杂交和捕获的回收产物中加入杂交缓冲液和全外显子探针进行第二次杂交和捕获；

8）捕获后文库扩增及纯化；在第二次杂交和捕获的回收产物中加入扩增引物和扩增酶进行文库扩增，纯化回收产物；

9）高通量测序：对扩增后的文库定量和质控后进行高通量测序。

2.根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤2）中，根据DV200质控值分别进行样本处理，对于DV200大于等于30%的RNA样本，取RNA样本5ul，加入4ul 5×第一链合成缓冲液，1ul随机引物，总体积10ul，置于PCR仪上，按照以下程序进行打断和引物杂交反应：94℃ 8min，4℃ 保持，热盖温度105℃；对于DV200小于30%的RNA样本，取RNA样本5ul，加入1ul随机引物，总体积6ul，置于PCR仪上，按照以下程序进行引物杂交反应：65℃5min，4℃ 保持，热盖温度105℃。

3. 根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤3）中，根据DV200质控值分别进行样本处理，对于DV200大于等于30%的RNA样本，取打断和引物杂交反应后的产物10ul，加入8μl链特异试剂和2μl第一链合成酶混合物，总体积20μl，置于PCR仪上，按照以下程序进行反应：25℃ 10min，42℃ 30min，60℃2min、42℃2min进行5个循环，70℃ 15min，4℃ 保持，热盖温度不低于80℃；对于DV200小于30%的RNA样本，取引物杂交反应后的产物6ul，加入4ul 5×第一链合成缓冲液，8μl链特异试剂和2μl第一链合成酶混合物，总体积20μl，置于PCR仪上，按照以下程序进行反应：25℃ 10min，42℃ 30min，60℃2min、42℃2min进行5个循环，70℃ 15min，4℃ 保持，热盖温度不低于80℃。

4. 根据权利要求1所述的一种基于高通量测序的mRNA检测方法，其特征在于：步骤4）中，合成cDNA第二链时，在第一链合成的产物中加入8μl 10×第二链合成缓冲液，4μl第二链合成酶混合物和48μl无核酶水，总体积80μl；置于PCR仪上，按照以下程序进行反应：16℃60min，4℃ 保持，热盖温度不高于40℃，或者不盖热盖；反应结束后，加入176μl纯化磁珠进行纯化，使用53μl 0.1× TE缓冲液进行洗脱，回收50μl产物。