[发明专利]一种基于高通量测序的mRNA检测方法

说明书

本发明涉及一种基于高通量测序的mRNA检测方法，包括如下步骤：1)提取样本总RNA并质控；2)根据总RNA质控情况进行总RNA打断和/或引物杂交；3)合成cDNA第一链；4)合成cDNA第二链；5)构建链特异性cDNA文库；6)第一次杂交和捕获；7)第二次杂交和捕获；8)捕获后文库扩增及纯化；9)高通量测序。本发明采用杂交捕获的方式，特异性富集链特异性cDNA序列，进行mRNA表达检测。本发明在极低起始量和低质量情况下仍能保证良好的检测性能。

技术领域

本发明涉及一种基于高通量测序平台开发的mRNA检测方法。

背景技术

已有大量研究表明，通过RNA测序的方法可以检测来自生物学样品中RNA分子标志物的相对表达频率。RNA测序也被称为全转录组鸟枪法测序，是基于NGS(Next-GenerationSequencing，第二代测序)的全转录组学研究方法。RNA测序需提取生物样品中的全部转录的RNA，然后反转录为cDNA后进行文库制备及高通量测序，在此基础上进行生物信息分析，进而可以对该生物样品的基因表达状况进行全局了解。一般提取到的总RNA中，核糖体RNA(rRNA)占比～90％，而基因表达的信息存储在信使RNA(mRNA)中。因此在进行建库测序之前，一般会先去除rRNA，富集mRNA后再进行建库流程。现有的mRNA测序技术，以基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获，以及基于rRNA去除的mRNA测序技术为主。

然而，出于多种情况，受限于样品量的原因，会出现RNA提取总量不高；同时由于样本保存原因，提取到的RNA通常降解比较严重等现象。现有mRNA测序技术应用有诸多不足之处。

基于poly(A)-尾巴的mRNA捕获技术是先用带有oligo-poly(T)的磁珠捕获含poly(A)-尾巴的mRNA，然后进行文库制备流程。文库制备一般含多个步骤(RNA破碎、cDNA第一链合成、第二链合成、末端修复加A、加接头、文库扩增)。对于严重降解的RNA样品，大量mRNA分子的3’末端不含有poly(A)-尾巴，因此无法被磁珠捕获得到，从而失去这一部分mRNA的数据信息。

基于rRNA去除的mRNA测序技术是先用特异性DNA探针结合rRNA，再用RNase H降解有DNA探针结合的RNA，回收到的mRNA再进行文库制备。文库制备一般含多个步骤(RNA破碎、cDNA第一链合成、第二链合成、末端修复加A、加接头、文库扩增)。RNase H降解法去除rRNA时会对mRNA造成一定损伤，因此此方法对起始RNA需求量较高，一般要求不少于1μg。同时，去除rRNA时不能有效去除内含子的片段，测序数据中内含子的数据占总数据的～50％。

综上所述，目前常用的mRNA测序技术有各自的缺点，在样品检测应用中有所限制，因此，急需一种可以适用于低投入量，低质量RNA测序的全面的系统性解决方案。

发明内容

本发明的主要目的，在于提供一种基于高通量测序的mRNA检测方法。可以适用于低投入量，低质量RNA的检测。

本发明的技术方案是，一种基于高通量测序的mRNA检测方法，包括如下步骤：

1)提取样本总RNA并质控：RNA总量不低于10ng(优选范围为大于100ng)，浓度不低于2ng/ul(优选范围为大于10ng/ul)，RNA的260/280吸光值在1.8-2.0之间，RIN值不低于1(优选范围为大于2)，DV200不低于20％(优选范围为大于30％)；

2)总RNA打断和/或引物杂交：其中，DV200大于等于30％的RNA样品，需要先打断，再进行引物杂交，对于DV200小于30％的RNA样品，不需要打断，直接进行引物杂交；所述的引物为随机引物，其长度范围为5-10bp；

3)合成第一链cDNA：在逆转录酶的作用下，以总RNA为模板，合成cDNA第一链；

4)合成第二链cDNA：在DNA聚合酶的作用下，以第一链cDNA为模板，合成含有dUTP的cDNA第二链；