[发明专利]绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因及其应用

说明书

本发明提出了绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合及其应用。具体组合方案如下：不同发育阶段稳定表达的内参基因组合为RPL27和RPL32，不同组织的内参基因组合为RPL27和RPL32，dsRNA处理条件下的内参基因组合为RPL27和EF1γ。还提出了该稳定表达内参基因用于荧光定量分析时所使用的不同引物序列。本发明首次确定了绿盲蝽在三种因子条件下最稳定的内参基因组合，为研究绿盲蝽在不同发育阶段、不同组织、以及dsRNA介导的RNA干扰条件下基因表达水平的分析提供了合适内参基因的选择，为研究绿盲蝽的基因功能以及RNAi介导的转基因作物的研发及其安全评价建立了夯实的基础。

技术领域

本发明属于昆虫分子生物学中实时荧光定量PCR内参基因表达稳定性的技术领域，更具体地，涉及绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合及其应用；包括绿盲蝽在不同发育阶段、不同组织以及dsRNA介导的RNA干扰条件下稳定表达的内参基因及应用。

背景技术

绿盲蝽(Apolygus lucorum)属于半翅目，盲蝽科，是我国棉花种植区域的主要害虫之一，其寄主范围十分广泛，主要包括棉花、玉米、大豆、苜蓿、十字花科蔬菜、茶树、花卉、以及各种果树等，给我国的农业和林业造成了巨大的经济损失。目前对其的防治主要以化学防治为主，但是化学药剂的长期使用容易导致抗药性的产生以及环境污染等问题。鉴于该害虫在农业经济上日益增涨的重要性，过去几十年来，昆虫学家们从生态学，生理学和分子生物学等角度对其进行了广泛的研究。随着高通量测序技术的发展，大量可能参与发育，免疫，能量代谢，繁殖，化学感受等生理过程的基因信息被报道。研究这些基因的功能，理解绿盲蝽各种生物学或生理学过程中的分子机制，对于开发新的盲蝽防治技术具有重要意义。

研究绿盲蝽体内特定基因的功能，最基本的技术方法之一就是对功能基因进行简单、快速、准确的表达定量分析。与传统的半定量RT-PCR，印记杂交等定量分析方法比较，实时荧光定量PCR具有操作简单、特异性强、灵敏度高、重复性好、成本低等优点，是一种最为广泛使用的基因表达分析技术。然而，一些实验因素，例如RNA提取中的批次间差异，cDNA合成和PCR反应的效率等等，这些非生物的变异均会影响实时荧光定量PCR的准确性。为了减少这些因素的影响，需要对数据进行标准化过程以消除非生物变异，其中最常用的策略是使用稳定表达参考基因作为数据标准化的内部参照，通常称为内参基因。因此，实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上取决于内参基因的选择。然而目前大量的研究表明，没有任何一个内参基因mRNA表达水平在所有的实验条件下都是恒定的。使用不稳定的内参基因作为数据标准化的内部参照会导致对定量数据的错误解释，最终导致错误的生物学结论。因此，选择一个在处理因素作用下表达相对稳定的基因作内参基因是实时荧光定量PCR成功与否的关键所在。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有绿盲蝽分子生物学研究过程中内参基因方案的缺乏，提供绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因及其应用；包括绿盲蝽在不同发育阶段、不同组织中以及dsRNA介导的RNA干扰条件下稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用。

本发明的目的是提供一种绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组。

本发明另一目的是提供一种绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合的筛选方法

本发明再一目的是提供所述绿盲蝽在不同因子下稳定表达的内参基因组合的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现