[发明专利]一种提取梨花粉管质膜的方法

权利要求书

1.一种提取梨花粉管质膜的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)、花粉采集：采集大蕾期梨花朵，分离出其花药，并干燥；

步骤(2)、花粉培养：分离干燥花药中的花粉，将其加入到液体培养基中，避光条件下，22～28℃，110～160rpm，培养4～5h；

步骤(3)、花粉管质膜的提取：将步骤(2)含有花粉管的液体培养基倒入钢丝网孔径为35μm的圆台形钢丝网研钵内，迅速使用吸水纸紧贴圆台形钢丝网研钵的底部，并及时更换吸水纸，直至液体培养基全部通过钢丝网网孔排出圆台形钢丝网研钵，然后迅速将圆台形钢丝网研钵放置在100ml烧杯上，烧杯下部埋入碎冰中，快速将2～3ml花粉管质膜提取液沿着圆台形钢丝网研钵两个加固条缓慢匀速加入到圆台形钢丝网研钵中，然后再用玻璃研棒以50～80rpm速度对花粉管进行匀浆，并间断性地添加花粉管质膜提取液使剥离的花粉管质膜组分连续经圆台形钢丝网研钵底部的网孔过滤至下部烧杯中，间断性地添加花粉管质膜提取液的量总计3～5ml；其中，花粉管质膜提取液配方为：400mM山梨醇，15mM TES，3mMEDTA，5mM PMSF，3mM DTT，0.1％m/v BSA，以NaOH调整pH至7.5；

步骤(4)、花粉管质膜的纯化：

a、差速离心：将步骤(3)获得的花粉管质膜粗提液加入到离心管中，快速在漩涡仪上以400～600rpm震动30～60s，并迅速在4℃、5000g的条件下离心10min，取上清；将离心得到的上清液再转移至新的离心管内，在4℃、80000g的条件下离心35min，去除上清，取沉淀；将离心得到的沉淀用1～2ml花粉管质膜提取液悬浮，并将其连同离心管埋入碎冰中；

b、Percoll密度梯度离心：将28％v/v和16％v/v的Percoll密度梯度液以1：1.2的体积比依次加入离心管中；将步骤(4)a得到的花粉管质膜悬浮液添加到16％v/v的Percoll密度梯度液顶部，然后在4℃、100000g的条件下进行离心45min；离心结束，16％v/v和28％v/v的Percoll密度梯度液之间为纯化获得的花粉管质膜组分；其中，28％v/v和16％v/v的Percoll密度梯度液配制如下：将Percoll溶于TES-NaOH缓冲液中制成16％v/v和28％v/v的Percoll溶液；所述TES-NaOH缓冲液配方为：15mM TES，200mM蔗糖，2mM EDTA，5mM PMSF，及2mM DTT，以NaOH调整pH至7.5；

步骤(5)、对纯化获得的花粉管质膜组分的洗涤：将纯化获得的花粉管质膜组分悬浮于其体积6～10倍的清洗液中，摇匀混合后迅速在4℃、85000g的条件下离心40min，离心结束后取沉淀即为分离纯化好的花粉管质膜组分，用清洗液悬浮沉淀备用；其中，清洗液配方为：15mM TES，200mM蔗糖，2mM EDTA，5mM PMSF，0.1％m/v BSA及2mM DTT，以NaOH调整pH至7.5；

其中，所述圆台形钢丝网研钵，包括第一部件、第二部件、第一钢丝网、第二钢丝网；

第一部件上部为中空圆台形，中空圆台形下部外壁变薄，中空圆台形上部和下部呈倒阶梯状；中空圆台形底部两侧各设一加固条，两加固条延伸方向和中空圆台形下部两侧延伸方向一致，两加固条壁厚和中空圆台形下部壁厚一致；两加固条底部为一圆台形圈，圆台形圈两侧延伸方向和两加固条延伸方向一致，圆台形圈壁厚和加固条壁厚一致；

第二部件顶部和底部各为一圆台形圈，顶部圆台形圈和底部圆台形圈两侧各通过一连接条连接；顶部圆台形圈延伸方向、尺寸和第一部件中空圆台形下部处钢丝网匹配，用于套设在第一部件中空圆台形下部处钢丝网的外部；两连接条延伸方向、尺寸和第一部件两加固条处钢丝网匹配，用于套设在两加固条处钢丝网的外部；底部圆台形圈延伸方向和第一部件圆台形圈外周处钢丝网匹配，上部壁厚和连接条壁厚一致，下部壁厚为加固条、钢丝网及连接条壁厚之和，底部圆台形圈内壁呈阶梯状，用于套设在第一部件圆台形圈外周及底部处钢丝网的外部；

第一部件中空圆台形下部至第一部件底端套设第一钢丝网，第一钢丝网呈圆台状，第一部件底部设第二钢丝网，第二钢丝网呈圆形，第二部件套设在第一钢丝网和第二钢丝网的外部；第二部件顶部圆台形圈和第一部件中空圆台形下部重合，之间为第一钢丝网；第二部件连接条和第一部件加固条重合，之间为第一钢丝网；第二部件底部圆台形圈和第一部件底部圆台形圈外周、底部重合，之间分别为第一钢丝网、第二钢丝网；第一部件、第一钢丝网、第二钢丝网、第二部件通过胶粘接。