[发明专利]一种提取梨花粉管质膜的方法有效

专利信息
申请号: 201911110343.2 申请日: 2019-11-14
公开(公告)号: CN110846269B 公开(公告)日: 2021-04-30
发明(设计)人: 高永彬;徐凯;楼宇航;郑伟尉;吴伯萍;冯心怡 申请(专利权)人: 浙江农林大学
主分类号: C12N5/04 分类号: C12N5/04
代理公司: 杭州奥创知识产权代理有限公司 33272 代理人: 杨嘉芳
地址: 311300 浙*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 一种 提取 梨花 质膜 方法
【说明书】:

发明公开一种提取梨花粉管质膜的方法,包括如下步骤:(1)采集梨花粉;(2)培养花粉长出花粉管;(3)花粉管质膜的提取:采用圆台形钢丝网研钵一步过滤收集花粉管,同时使用玻璃研棒对花粉管进行破壁,剥离质膜组分随着提取液通过研钵底部钢丝网孔过滤至预冷烧杯中;(4)质膜组分纯化:通过差速离心结合Percoll密度梯度离心获得较纯的质膜组分;(5)质膜组分的洗涤:通过清洗液对纯化后的质膜组分进行洗涤。经上述系列步骤提取纯化后的梨花粉管质膜组分没有液泡及内质网等膜组分污染,几乎没有细胞质及线粒体等组分污染,可用于后续花粉管质膜蛋白质组及相关酶活性等研究,对于研究梨花粉管生长发育调控具有重要意义。

技术领域

本发明涉及植物细胞生物学技术领域,具体涉及一种提取梨花粉管质膜的方法。

背景技术

植物细胞壁内由质膜将细胞包裹,质膜使细胞内含物与外界环境隔离开,细胞与外界环境发生的一切都需要经过质膜进行。其中包括细胞对离子吸收,胞内内含物的排出,信号物质的释放及外界信号的感知与接收等生理生化代谢过程。为完成这些代谢,在质膜上存在各种离子通道,同时还镶嵌着许多转运功能蛋白及其他作用的蛋白。质膜上的蛋白或活性酶对细胞的生长发育调控具有极其重要的作用。因此提取纯化质膜组分对于深入研究细胞生长发育调控具有重要意义。

当前植物质膜的提取技术大多采用传统的陶瓷研钵研磨植物组织,经纱布过滤,然后通过离心后经两相分离获得质膜囊泡组分。比如泡桐幼苗根质膜(洪剑明,贾慧君,郑槐明.水双相法分离泡桐幼苗根细胞质膜的研究.林业科学.2001(01):23-27.)、苹果根质膜正向型囊泡(朱京涛,韩振海,许雪峰.苹果根细胞质膜的提取和纯化.果树学报.2003(03):230-232.)及水稻叶片质膜(李栎,纪春艳,王振中.水稻叶片质膜蛋白的提取与纯化.江苏农业科学.2013(06):44-46.)等的提取纯化。此外,胡杨(张玲,刘群录,黄有国.胡杨质膜的纯化及其H+-ATPase活性的研究.生物化学与生物物理进展.2000(06):637-640.)质膜的提取技术主要采用尼龙网过滤悬浮培养的胡杨细胞,然后加入捣碎液在捣碎机上将细胞捣碎,再经四层纱布过滤,离心分离及两相体系纯化获得质膜微囊。相比于其他植物的组织或细胞,梨花粉管具有其自身的特性。梨花粉粒平均直径约为45~50μm,花粉萌发长出的花粉管直径约是花粉粒的1/5,当花粉萌发后4h,花粉管的长度约为300μm。当使用液体培养基培养好花粉管后,需要将花粉管与培养基分离,才能进一步做相关的提取实验。传统的纱布过滤步骤虽然可以将大部分花粉管从培养基中分离出来,但是大量花粉管会交错附着在纱布孔中,难以将其转移到破壁的相关装置中进行破壁。同时,使用传统的研钵进行研磨,花粉管会悬浮在研磨液中,研棒难以将其破壁并剥离质膜组分。此外,传统的液氮研磨方法也不适用于花粉管质膜提取,液氮研磨方法会破坏线粒体及液泡等细胞器,极易污染质膜组分,无法获得高质量质膜组分。另外,目前植物组织质膜纯化多采用的两相分离技术存在步骤繁琐等不足。总之,当前的植物组织质膜提取纯化技术用于提取梨花粉管质膜存在诸多缺陷,不适合梨花粉管质膜组分的提取,因此建立一套梨花粉管质膜提取纯化技术对于研究梨花粉管生长发育调控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取梨花粉管质膜的方法,以解决现有技术的不足。

本发明采用以下技术方案:

一种提取梨花粉管质膜的方法,包括如下步骤:

步骤(1)、花粉采集:采集大蕾期梨花朵,分离出其花药,并干燥;

步骤(2)、花粉培养:分离干燥花药中的花粉,将其加入到液体培养基中,避光条件下,22~28℃,110~160rpm,培养4~5h;

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