[发明专利]一种测定核酸适配体亲和力的通用方法

说明书

本发明涉及一种测定核酸适配体亲和力的通用方法，利用具有不同带电量的吸附质对纳米金(GNP)稳定性影响的差异，通过GNP的颜色变化或粒径变化进行核酸适配体亲和力定量测定。方便地用于核酸适削体筛选、解离常数(K_D)测定和核酸适配体结合位点研究。该方法无需标记、无需对核酸适配体或者靶标进行固相固定的，避免了标记和固相固定对核酸适配体亲和力的影响。K_D检测灵敏度高于0.3nM，可进行高通量亲和力测定。通用性好，适用于各种蛋白质靶标和部分小分子靶标与核酸适配体的相互作用的亲和力测定。操作简单，无需特殊训练，成本低廉，速度快，可扩展到对核酸适配体体以外其它核酸与蛋白质的相互作用研究。

技术领域

本发明涉及一种测定核酸适配体亲和力的通用方法，属于生物技术领域。

背景技术

核酸适配体是具有特异性分子识别能力的寡核苷酸，通常通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从合成的随机核酸库中分离获得(Science，1990，249，505-510；Nature，1990，346，818-822)。核酸适配体与抗体相比具有许多优点，在生物传感器、药物靶向和治疗等领域有着广泛的应用前景。近些年来，SELEX技术取得了巨大的进展(AccountsChem.Res.2016，49 1903-1910；Talanta 2019，200 124-144；Biotechnol.Adv.2017，35，275-301)。然而，核酸适配体的鉴定，包括筛选(screening，通常大于50个候选序列)、解离常数(K_D)的测定以及核酸适配体结合位点的确定，仍然非常耗时、昂贵、缺乏标准化的通用表征技术。

与抗体不同的是，核酸适配体体积小，具有多样和不稳定的二级结构。因此，将核酸适配体或者靶标在固相上固定，对核酸适配体进行标记都可能会极大地影响它们的结合亲和力，导致不同技术得到的结果常常不一致(Anal.Chem.2015，87，8608-8612)。所以，在不进行固相同定和标记的情况下测定核酸适配体的亲和力(业就是其固有亲和力)对其实际应用至关重要。但是目前大多数的核酸适配体亲和力鉴定方法都需要对核酸适体进行标记和/或固定，以实现信号转导或样品分离(Biotechnol.Adv.2017，35，275-301；Analyst2018，143，5317-5338；Anal.Chim.Acta.2011，686，9-18；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A2013，110，18460-18465；Anal.Chem.2014，86，5559-66；Anal.Chem.2016，88，8294-8301；Angew.Chem.Iht.Ed.2010，49，2238-2241)。测定核酸适配体固有亲和力的技术非常少。迄今为止，只有等温热滴定技术(ITC)被广泛使用(Anal.Chem.1990，62，950-959；Nat.Protoc.2006，1，186-191；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A2004，101，9517)。然而，ITC具有非常低的通量，需要大的样品体积(几百微升)，并且不适用于具有低焓变或大稀释热的分子相互作用的研究。基于焓测定的ITC阵列仅需500nL样品就可用于高通量的分子相互作用测量(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2004，101，9517)。然而，该方法的灵敏度差，限制了可测量的亲和力范围(K_D＞50μM)。背散射干涉测量法(BSI)是一种在微流体系统中进行的相对较新的均相无标记技术，具有前所未有的灵敏度(皮摩尔每升的K_D)和非常宽的K_D动力学范围(从约20pM到20μM)(Science 2007，317，1732-1736；Nature biotechnology 2011，29，357-360.)。然而，现有的文献对BSI的传感机制缺乏物理解释，已有多个矛盾的研究被报道，并对其普适性和高灵敏度提出质疑(Analyst 2015，140，895-901；Sens.Actuators BChem.2015，220，1328-1337)。

发明内容