[发明专利]一种固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法

权利要求书

1.一种固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)合成铁调素-25多肽链：使用含有20％哌啶的DMF溶液去除氨基酸的保护基团使其暴露氨基；将被保护的氨基酸活化后加入使其与上一个氨基酸的游离氨基连接；重复此步骤25次得到含有25个氨基酸残基的肽链；使用含有20％哌啶的DMF溶液去除最后一个氨基酸的保护基团使其暴露末端氨基，使用BOC保护基团保护末端游离的氨基；

(2)5-TMARA标记多肽；使用含有2％水合肼的DMF溶液去除21号赖氨酸残基上的Dde侧链保护基团，将5-TMARA荧光标记物连接到21号赖氨酸残基上；

(3)除去侧链保护基和从树脂上移除多肽：去除所有的侧链保护基团并将多肽链从树脂上切除；

(4)还原剂的制备和多肽的还原：还原多肽链避免暴露在空气中形成二硫键；

(5)纯化和折叠粗多肽溶液；将肽链加入配好的反应液中使其折叠并形成链内二硫键；纯化得到多肽5-TMARA标记的铁调素-25。

2.根据权利要求1所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，步骤(1)合成铁调素-25多肽链的具体步骤如下：

1)取干燥的Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂装柱；向柱中加入DMF并在旋转仪上转动，待树脂溶胀后，通过真空抽滤除去溶液并使用DMF再次洗涤树脂；随后加入含有20％哌啶的DMF溶液并将柱子旋转除去Fmoc基团；氨基酸脱保护后使用DMF洗涤若干次以确保树脂中没有残留的哌啶；

2)将适量的氨基酸和HBTU溶解在无水DMF中，然后加入适量的TMR，搅拌使其充分活化；将反应溶液加入到准备好的树脂中，并将柱子放在旋转仪上旋转反应；使用DIC和Oxyma进行活化步骤，链接完一个氨基酸残基后，通过TNBS试验测试树脂，以确保所有上一个氨基酸游离的N-末端氨基与下一个氨基酸的羧基连接；

3)根据铁调素-25的序列，对每个随后的氨基酸重复上述循环；完成肽链的合成后，加入含有20％哌啶的DMF溶液以除去肽链末端Fmoc-基团，并通过使用DIPCDI和Oxyma将Boc-基团与末端氨基酸连接。

3.根据权利要求2所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，通过TNBS试验即一滴Picrylsulfonic acid和一滴N，N'-二异丙基乙胺测试树脂以确保所有Fmoc基团都被去除。

4.根据权利要求2所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，活化时，氨基酸、HBTU、无水DMF和TMR的用量比为：1.2mmol：1.2mmol：2.6ml：2.4mol。

5.根据权利要求1所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，步骤(2)5-TMARA标记多肽的具体步骤如下：

用含有2％水合肼的DMF溶液除去第21个氨基酸Fmoc-Lys(Dde)-OH的Dde侧链保护基；使用DMF洗涤4次以确保树脂没有残留的水合肼，再使用纯DMF洗涤树脂以确保柱中没有残留的水；最后向柱中加入过量的5-TMARA，适量的氧化胺、DIC和DMF溶液，将柱轻轻旋转24小时。

6.根据权利要求1所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特征在于，步骤(3)除去侧链保护基和从树脂上移除多肽具体步骤如下：

用DMF洗去残留的5-TMARA，Oxyma和DIPCDI后，用甲醇和乙醚洗涤树脂以收缩树脂，再将柱子真空干燥；按水/苯酚/DODT/TFA/茴香硫醚/三乙基硅烷：500μl/50mg/500μl/250μl/8.25ml/100μl组成的裂解溶液并加入到干燥的树脂中，混合，静置；反应结束后，将裂解混合物过滤到离心管中，并将乙醚加入离心管中进行离心提取肽链，并使用乙醚离心洗涤肽链3次，每次5分钟，3500rpm；最后将提取的肽链溶解于0.1％TFA/水中并冷冻干燥。