[发明专利]一种固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法

说明书

本发明是一种固相合成5‑TMARA标记的铁调素‑25的方法，属多肽合成技术领域。其步骤如下：合成铁调素‑25多肽链；5‑TMARA标记多肽；使用含有2％水合肼的DMF溶液去除21号赖氨酸残基上的Dde侧链保护基团，将5‑TMARA荧光标记物连接到21号赖氨酸残基上；除去侧链保护基和从树脂上移除多肽；还原剂的制备和多肽的还原；纯化和折叠粗多肽溶液；纯化得到多肽5‑TMARA标记的铁调素‑25。本发明方法采用固相合成，操作简单，可在实验室大量制备铁调素‑25，所制得的铁调素‑25纯度高，方法合成周期短，5‑TMARA标记的铁调素可用于后期生物体内的跟踪实验。

技术领域

本发明涉及多肽的合成方法，特别是一种固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，属于多肽制备技术领域。

背景技术

铁调素是人体内的一种铁平衡调节多肽。活性多肽铁调素-25主要是在肝脏中产生，通过蛋白质溶解切割前铁调素的C-端的25个氨基酸所产生的。随后，N-端的铁调素-25转化为更小的多肽(大约20～24个氨基酸)，这些多肽活性更低并且在尿液中累积。目前有多项研究已把铁调素作为炎症性贫血的潜在生物标记物，使其在恶性贫血检测方面具有重要意义。现有技术中多是采用基因工程制备多肽，其缺陷主要体现在：

1.成本高且时间周期长，不适实验室制备；

2.技术不成熟，失败率高；

3.分子量小的多肽纯化困难，酶切后多肽难回收；

4.质量控制难度较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高收率、低成本、反应条件温和、可在实验室大量制备，有利于进行生物体内跟踪实验的荧光标记的铁调素的合成方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其特点是，其步骤如下：

(1)合成铁调素-25多肽链：使用含有20％哌啶的DMF溶液去除氨基酸的保护基团使其暴露氨基；将被保护的氨基酸活化后加入使其与上一个氨基酸的游离氨基连接；重复此步骤25次得到含有25个氨基酸残基的肽链；使用含有20％哌啶的DMF溶液去除最后一个氨基酸的保护基团使其暴露末端氨基，使用BOC保护基团保护末端游离的氨基；

(2)5-TMARA标记多肽；使用含有2％水合肼的DMF溶液去除21号赖氨酸残基上的Dde侧链保护基团，将5-TMARA荧光标记物连接到21号赖氨酸残基上；

(3)除去侧链保护基和从树脂上移除多肽：去除所有的侧链保护基团并将多肽链从树脂上切除；

(4)还原剂的制备和多肽的还原：还原多肽链避免暴露在空气中形成二硫键；

(5)纯化和折叠粗多肽溶液；将肽链加入配好的反应液中使其折叠并形成链内二硫键；纯化得到多肽5-TMARA标记的铁调素-25。

本发明所述的固相合成5-TMARA标记的铁调素-25的方法，其进一步优选的技术方案是，步骤(1)合成铁调素-25多肽链的具体步骤如下：

1)取干燥的Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂装柱；向柱中加入DMF并在旋转仪上转动，待树脂溶胀后，通过真空抽滤除去溶液并使用DMF再次洗涤树脂；随后加入含有20％哌啶的DMF溶液并将柱子旋转除去Fmoc基团；氨基酸脱保护后使用DMF洗涤若干次以确保树脂中没有残留的哌啶；

2)将适量的氨基酸和HBTU溶解在无水DMF中，然后加入适量的TMR，搅拌使其充分活化；将反应溶液加入到准备好的树脂中，并将柱子放在旋转仪上旋转反应；使用DIC和Oxyma进行活化步骤，链接完一个氨基酸残基后，通过TNBS试验测试树脂，以确保所有上一个氨基酸游离的N-末端氨基与下一个氨基酸的羧基连接；