[发明专利]一种基于香豆素的检测革兰氏阳性菌的免洗荧光探针及应用

说明书

本发明提供了一种基于香豆素的检测革兰氏阳性菌的免洗荧光探针及应用，其化学结构式如下。本发明设计的荧光探针对微环境的极性有灵敏的荧光响应。探针在强极性溶液中显示非常弱的荧光，在弱极性溶液中显示强的荧光。探针在阴离子表面活性剂、两性表面活性剂和中性表面活性剂的水溶液中没有明显的荧光变化，在阳离子表面活性剂溶液中显示非常强的荧光。探针与革兰氏阳性菌特异性结合并显示非常强的荧光，革兰氏阴性菌、真菌和哺乳动物细胞不能导致明显的荧光变化。该类型探针是一种特异性的免洗检测革兰氏阳性菌的有效工具，可用于医疗卫生、生产生活等各种领域革兰氏阳性菌的检测。

技术领域

本发明涉及表面活性剂及检测革兰氏阳性菌的荧光探针制备领域，具体涉及一种基于香豆素的检测革兰氏阳性菌的免洗荧光探针及应用。

背景技术

在过去的几十年中，细菌感染性疾病对人类健康提出了严峻挑战，并日益引起医学界和公众的关注。全世界每年都会有数百万人的感染。此外，占医院感染25％的手术部位感染(SSI) 主要是由革兰氏阳性细菌引起的。同时，肿瘤中的某些革兰氏阳性细菌可以明显增强化学耐药性并降低化疗药物的疗效，并促进肿瘤的生长和转移。考虑到革兰氏阳性细菌的巨大威胁，迅速地区分革兰氏阳性细菌成为了首要任务。

革兰氏染色法是区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的一种常用的传统方法，但是这种策略需要繁琐的工作并且缺乏实现对活菌原位检测的能力。其他常规细菌鉴定方法，包括聚合酶链反应在内的文献报道(PCR)，DNA芯片，免疫技术，质量光谱法，表面增强拉曼光谱 (SERS)和生物传感技术通常耗时、成本和能源消耗大，并且需要复杂的仪器，这些缺点极大地限制了它们在临床的应用。

目前常规检测采用传统培养方法，每种病菌需进行单独的培养，单独进行检测，工作量大；而使用荧光定量单个检测方法逐个操作，配置反应体系数目多，要消耗大量的试剂、人力、物力和时间；免疫学方法检测需要寻找高灵敏度和特异性的抗原，且试剂昂贵，操作复杂。虽然现在有探针可以区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，但哺乳动物细胞也容易被染色。

因此，开发易合成、选择性好，且不对细胞产生干扰，实现迅速地区分革兰氏阳性细菌且不对哺乳动物细胞产生干扰的探针尤为重要。

发明内容

本发明提出了一种基于香豆素的检测革兰氏阳性菌的免洗荧光探针及应用，以香豆素为母体构建荧光探针。探针是以香豆素为母体，主要官能团为羧基，由于羧基的转动在强极性条件下荧光很弱，该探针对阳离子表面活性剂有荧光增强型响应，进而做了细菌筛选，发现探针能特异性检测革兰氏阳性菌。

实现本发明的技术方案是：

一种基于香豆素的检测革兰氏阳性菌的免洗荧光探针，结构式如下所示：

所述的基于香豆素的检测革兰氏阳性菌的免洗荧光探针，制备步骤如下：

(1)将草酰乙二酸二乙酯和3-(二甲基氨基)苯酚或3-(二乙基氨基)苯酚的混合物在 120℃下搅拌3小时，冷却后，将反应混合物用CH₂Cl₂稀释，将其通过硅胶柱色谱法纯化，得橙色固体；

(2)将步骤(1)得到的橙色固体溶于乙醇中，之后加入氢氧化钠溶液，将得到的混合物回流后冷却至室温，向混合物加入水，调节pH，得到沉淀，将沉淀过滤、洗涤得到荧光探针。

所述步骤(1)中草酰乙二酸二乙酯和3-(二甲基氨基)苯酚或3-(二乙基氨基)苯酚的摩尔比为1:1。

所述步骤(2)加入氢氧化钠溶液调节pH至2-3。

所述步骤(2)中回流时间为3h，pH调节至2-3。

所述的基于香豆素的检测革兰氏阳性菌的免洗荧光探针在检测革兰氏阳性菌中的应用。