[发明专利]一株高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株可整合且高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用。该菌株具体为解淀粉芽孢杆菌ZD‑708(ΔGAΔEGL)，是在一株可高效产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌LKT‑10261的基础上，经过ARTP诱变后获得ZD‑708菌株，在ZD‑708菌株基础上敲除糖化酶基因GA和纤维素酶基因EGL所得，并且其限制修饰系统对pKS1质粒的剪切修饰已失效。该菌株发酵培养获得的中性蛋白酶酶活为20200‑21930U/ml，上清中的蛋白含量为95‑100mg/mL，所表达的蛋白酶活水平高，大大降低了生产成本，拓宽了酶的应用领域。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株可整合且高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

随着生物技术的发展，为了降低生产成本、拓展作用条件及范围，满足市场多样化产品的需求，需要开发或者优化出多株针对不同产品的，产酶活力高、生产稳定性好、适应强的生产菌株。由于多个新菌株的开发耗时较长，且往往是多个品种的酶产品由同一类的菌株来生产，因此，利用同一类表达系统的菌株，生产多个不同的酶产品，会使生产研发的速度加快，紧跟市场瞬息万变的行业动态，最大限度度的满足市场的各种需求。例如毕赤酵母的表达系统，枯草芽孢杆菌的表达系统，地衣芽孢杆菌的表达系统等等。

解淀粉芽孢杆菌为芽孢杆菌属，是美国食品和药品管理局公认的安全微生物。从上世纪60年代开始就有报道，2007年公布的解淀粉芽孢杆菌FZB42的全基因组序列，使人们更深入的认识了解解淀粉芽孢杆菌。该菌不污染环境，在自然界分布广泛，易分离培养，且生长快，稳定性好，目前已广泛用于酶制剂生产。

DNA同源重组的方法敲除目的基因，即设计目的基因两边相邻的基因片段并连接在一起，通过转化宿主细胞，在宿主内通过此相邻片段与目的基因两边相同片段的交换重组，完成对目的基因的敲除。在此敲除过程中，载体、转化方法和筛选标记的选择对建立一个高效稳定的操作体系产生重要影响。

温敏型质粒是一类可以在特定温度下可以自主复制，而高于特定温度时无法自主复制的质粒。同时温敏型质粒将质粒转化入宿主细胞和在宿主细胞中发生同源重组的两个过程分开进行，极大的提高了敲除的成功率，特别是对于解淀粉芽孢杆菌这种难转化的细菌类型。温敏型质粒例如pE194和pKS1等，其中pE194使用的时间最早，最广泛，但质粒本身较大，转化难度相对较大，且在使用过程中，在一些菌株中会出现对温度不敏感的情况，当温度升高至40度时，仍有部分细胞中的质粒会保持游离状态。pKS1在30度时自主复制，37度时停止复制，对温度的变化更为敏感。2010年Zakataeva等首次将pKS1质粒运用到解淀粉芽孢杆菌中，同时建立了解淀粉芽孢杆菌的敲除方法。

野生型解淀粉芽孢杆菌的转化率较低，且由于菌体内修饰系统的限制，目前，针对解淀粉芽孢杆菌的筛选及针对其表达系统改造的专利，未见报道。

发明内容：

本发明首先提供一株可高效分泌表达中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，该菌株具体为解淀粉芽孢杆菌(Bacilluse amyloliquefaciens)ZD-708(ΔGAΔEGL)，是在一株可高效产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌LKT-10261的基础上，经过ARTP诱变后获得ZD-708菌株，在ZD-708菌株基础上敲除糖化酶基因GA和纤维素酶基因EGL所得，并且其限制修饰系统对pKS1质粒的剪切修饰已失效；

所述糖化酶基因GA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述纤维素酶基因EGL的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

解淀粉芽孢杆菌(Bacilluse amyloliquefaciens)ZD-708菌株已于2019年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏号为CGMCC NO.18644。